土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较生命科学学院专业:生物科学学号：姓名：指导教师徐军韩炎摘要：本实验是微生物学综合性实验项目，包含了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数（即活菌计数）、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的培养特征和形态特征、制片染色技术等。
本文记录了对采自校园附近农田的土样中微生物主要类群的分离和纯化等试验操作方法和结果。
所采每克土样中几种不同类群微生物的含量分别为：细菌9.0×106个、放线菌5.04×105个、霉菌1.44×105个，说明土壤中微生物种类的繁多和数量的庞大。
培养基的种类和组分的不同可用于分离或富集不同的微生物。
关键词：分离纯化平板菌落计数微生物的形态1前言：（1）、微生物在自然界及其在土壤中的分布简况；微生物在自然界中的分布微生物种类繁多，繁殖迅速，适应环境能力强，因此广泛分布于自然界中，无论是陆地、水体、空气、动植物以及人体的外表面和内部的某些器官，甚至在一些极端环境中都有微生物的存在。
土壤中的微生物自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境，它具有微生物所需要的一切营养物质和微生物进行生长和繁殖及生命活动的各种条件。
大多数微生物不能进行光合作用，需要靠有机物来生活，进入土壤中的有机物为微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中的矿质元素的含量浓度也很适于微生物的生长；土壤中的水分虽然变化较大，但基本上可以满足微生物的需要；土壤的酸碱度接近中性，缓冲性较强，适合大多数微生物生长；土壤的渗透压大都不超过微生物的渗透压；土壤空隙中充满着空气和水分，为好氧和厌氧微生物的生长提供了良好的环境。
此外，土壤的保温性能好，与空气相比，昼夜温差和季节温差的变化不大。
在表土几毫米以下，微生物便可免于被阳光直射致死。
这些都为微生物生长繁殖提供了有利的条件。
所以土壤有“微生物天然培养基”之称，这里的微生物数量最大，类型最多，是人类最丰富的“菌种资源库”。
土壤中的微生物分布，土壤中微生物的数量和种类都很多，包含细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等类群。
其中细菌最多，约占土壤微生物总量的 70 ％一 90 ％，放线菌、真菌次之，藻类和原生动物等较少。
土壤微生物通过其代谢活动可改变土壤的理化性质，进行物质转化，因此，土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。
土壤的营养状况、温度和 pH 等对微生物的分布影响较大。
在有机质含量丰富的黑土、草甸土、磷质石灰土和植被茂盛的暗棕壤中，微生物的数量较多；而在西北干旱地区的棕钙土，华中、华南地区的红壤和砖红壤，以及沿海地区的滨海盐土中，微生物的数量最少。
在土壤的不同深度微生物的分布也不相同。
其主要原因是由于土壤不同层次中的水分、养料、通气、温度等环境因子的差异，及微生物的特性不同。
表面土的微生物数量少，因为这里缺水，受紫外线照射微生物易死亡；在 5~ 20cm 土壤层中微生物数量最多，若是植物根系附近，微生物数量更多。
自 20cm 以下，微生物数量随土层深度增加而减少，至 lm 深处减少约 20 倍，至 2m 深处，因缺乏营养和氧气每克土中仅有几个。
土壤中微生物数量的季节变化是温度、水分、有机残体综合影响的表现。
一般，冬季气温低，有些地区土壤几个月呈冰冻状态，微生物数量明显减少。
当春季到来，气温回升，随着植物的生长，根系分泌物增加，微生物的数量迅速上升。
有的地区，夏季炎热干旱，微生物数量也随之下降，至秋天雨水来临，加上秋收后大量植物残体进入土壤，微生物数量又急剧上升。
这样，在一年里土壤中会出现两个微生物数量高峰。
（2）土壤中各种类群的微生物的含量的大致情况：尽管土壤中各种微生物含量的变动很大，但每克土壤的含菌量大体上有一个十倍系列的递减规律：细菌（～108）＞放线菌（～107）＞霉菌（～106）＞酵母菌（～105）＞藻类（～104）＞原生动物（～103）。
由此可见，土壤中所含的微生物数量很大，尤其以细菌居多。
据估计，在每亩耕作层土壤中，约有霉菌150㎏，细菌75㎏，原生动物15㎏，藻类7.5㎏，酵母菌7.5㎏。
（3）土壤中的微生物的作用；土壤微生物大部分对作物生长发育是有益的，它们对土壤的形成发育、物质循环和肥力演变等均有重大影响。
对作物来讲是影响其生长发育的重要环境条件之一，其具体作用是：①形成土壤结构，作为土壤的活跃组成分,土壤微生物的区系组成、生物量及其生命活动对土壤的形成和发育有密切关系。
有活性的土壤是由固态的土壤、液态的水和气态的空气共同组成的，单纯的土壤颗粒和化肥所构成的并不是真正意义上的土壤。
土壤微生物通过代谢活动的氧气和二氧化碳的交换，以及分泌的有机酸等有助于土壤粒子形成大的团粒结构，最终形成真正意义上的土壤。
②分解有机质，作物的残根败叶和施入土壤中的有机肥料，只有经过土壤微生物的作用，才能腐烂分解，释放出营养元素，供作物利用，并形成腐殖质，改善土壤的结构和耕性。
③分解矿物质，土壤微生物的代谢产物能促进土壤中难溶性物质的溶解。
例如磷细菌能分解出磷矿石中的磷，钾细菌能分解出钾矿石中的钾，以利作物吸收利用，提高土壤肥力。
另外，尿素的分解利用也离不开土壤微生物。
④固氮作用，氮气占空气组成的4/5，但植物不能直接利用，某些微生物可借助其固氮作用将空气中的氮气转化为植物能够利用的固定态氮化物。
⑤调节植物生长，土壤微生物与植物根部营养有密切关系。
植物根际微生物以及与植物共生的微生物如根瘤菌、菌根和真菌等能为植物直接提供氮素、磷素和其他矿质元素的营养以及有机酸、氨基酸、维生素、生长素等各种有机营养，促进植物的生长。
⑥防治土传病害，土壤中存在一些抗生性微生物，他们能够分泌抗生素，抑制病原菌的繁殖，防治土传病原菌对作物的危害。
⑦降解土壤中残留的有机农药、城市污物和工厂废弃物等，降低残毒为害。
⑧某些微生物可用于沼气发酵，提供生物能源、发酵液和残渣有机肥料（4）本实验的主要过程和实验结果。
本实验通过采样、选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数)、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、等方法，对土壤中的微生物进行分离计数，并通过革兰氏染色等实验观察方法对微生物个体形态等进行培养与观察，以及制片染色技术等。
结果发现土壤中微生物的含量极为丰富，含有霉菌，细菌，放线菌菌种。
通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。
2 材料与方法2.1材料2.1.1土样：以无菌方式采于学校内小园林，置于无菌容器中，待检。
2.1.2培养基2.1.2.1营养琼脂（牛肉膏蛋白胨固体培养基）[1]：牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；琼脂15-20g；水1000ml；PH 7.0-7.2。
灭菌条件：121℃灭菌20min。
2.1.2.2高氏一号固体培养基[1]：可溶性淀粉20g；KNO3 1g；NaCl 0.5g；K2HPO40.5g； MgSO40.5g;FeSO40.01g; 琼脂 20g; 水 1000ml; PH 7.2-7.4。
配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。
121℃灭菌20min。
灭菌后，在100ml培养基中加入10%酚溶液5滴（作为抑制剂，以抑制细菌的生长），制备平板备用。
2.1.2.3查氏固体培养基[1]：NaNO32g；K2HPO41g；KCl 0.5g；MgSO40.5g；FeSO40.01g；蔗糖 30g；琼脂 15-20g；水 1000ml；PH 自然。
灭菌条件：121℃灭菌20min。
2.1.2.4马丁氏培养基[1]：葡萄糖 10g；蛋白胨 5g；KH2PO41g；MgSO4·7H2O 0.5g；1/3000孟加拉红(玫瑰红水溶液) 100ml；琼脂15-20g；蒸馏水 800ml；PH自然。
灭菌条件：121℃灭菌20min。
临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml,使每毫升培养基中含链霉素30ug。
2.1.2.5无菌水：装有90ml蒸馏水和数十粒玻璃珠的250ml锥形瓶一只，装有9ml蒸馏水的18×180mm试管数支；121.3℃， 20分钟灭菌，备用。
2.1.3染色液2.1.3.1革兰氏染色液[1]：用于革兰氏染色的四种溶液1 草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫 2g；95%乙醇 20ml。
B液：草酸铵 0.8g；蒸馏水 80ml。
混合A、B二液，静置48h后使用。
2 卢戈氏碘液碘片 1g；碘化钾 2g；蒸馏水 300ml。
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。
3 95%乙醇溶液4 番红复染液番红 2.5g；95%乙醇 100ml。
取上述配好的番红乙醇溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。
2.1.3.2 0.1%美蓝[1]用于放线菌菌丝形态观察2.1.3.3乳酸石炭酸棉蓝液[1]石炭酸 10g；乳酸(相对密度1.21) 10ml；甘油20ml；蒸馏水10ml；棉蓝0.02g。
将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。
2.2方法2.2.1制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使土样与水充分混合，将细胞分散。
静置，成为土壤悬液(10-1)。
用1mL的无菌移液管从中吸取1mL 土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀(10-2)。
然后再用另一支1mL移液管，从此管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中(10-3)，依此类推制成10-4，10-5，10-6 各种稀释度的土壤溶液。
如下图所示制备土壤稀释液示意图2.2.2制备及涂布平板营养琼脂平板9个，用于分离细菌，其中三个平板加入浓度为10-6的稀释液各0.2mL，三个平板加入浓度为10-5的稀释液各0.2mL，三个加入浓度为10-4的稀释液各0.2mL，做好标记；高氏一号培养基平板9个，用于分离放线菌，用一支1mlL无菌移液管分别从稀释度10-5、10-4和10-3的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的平板中，每个浓度做三个平板；查氏培养基平板9个，用于培养霉菌，用一支1mlL无菌移液管分别从稀释度10-4、10-3和10-2的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的平板中，每个浓度做三个平板；马丁氏培养基9个，用于分离真菌，用一支1mlL无菌移液管分别从稀释度、10-4、10-3和10-2的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的平板中，每个浓度做三个平板。
用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。
2.2.3培养培养基2.1.2.1平板倒置于37℃培养箱，2～3天；培养基2.1.2.2平板倒置于28℃培养箱5～7天；培养基2.1.2.3和培养基2.1.2.4平板倒置于28℃培养箱3～5天；2.2.4菌落计数培养结束后，根据不同类群的微生物的菌落特征，分别在不同的培养基平板上统计相关类群的微生物菌落，即培养基2.1.2.1统计细菌的菌落；培养基2.1.2.2统计放线菌的菌落；培养基2.1.2.3和培养基2.1.2.4统计霉菌的菌落。