用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去 多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上， 使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。 点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2-3µL血清，均 匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内， 如图3-6所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定 宽度、粗细均匀的直线。
光密度总和T＝A+α1＋α2＋β＋γ 各部分蛋白质的分数为：
A（清蛋白）% = A / T×100
α1-球蛋白 % = α1 / T×100 α2-球蛋白 % =α2 / T×100 β-球蛋白 % = β / T×100
γ-球蛋白 % =γ / T×100
附：迁移率是胶体颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质 等物质以及研究它们的某些理化性质．现将人血浆蛋白质 的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。
① 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择
用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液 的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15-30s内迅速 润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用 于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条 纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以 免影响电泳结果。
将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲 液中约30min后，方可用于电泳。
混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，
混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 ④保存液：液体石蜡。 ⑤定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）： 称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容
至1000ml。
【 实验方法与步骤】
1、仪器与薄膜的准备
2．电泳

将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，
无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极，槽
架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待
平衡5 min后通电，电压为110 V，电流为0.4～
0.6 mA/cm，通电1 h左右关闭电源。
【实验方法】
1．准备与点样
(1)将薄膜切成2.5 cm×8 cm的小片。在薄膜无 光泽面(正面)的一端约2 cm处用硬铅笔划一点样 线。
(2)将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲中， 使 膜条自然浸湿 。
(3)将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓 冲液，把膜条置洁净滤纸上。
(4)用载玻片点样。
点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样 时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印 出凹陷而影响电泳区带分离效果。
⑷ 电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度 为0.4-0.5mA/cm宽膜为宜。
电流强度高，则热效应高，尤其在温度较高的环 境中，可引起蛋白变性或由于热效应引起缓冲液 中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。 电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。
⑸ 染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点 加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的 着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料， 不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素薄膜 溶解。
应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去； 时间太短，着色浅不易区分，或造成条带染色不 均匀，必要时可进行复染。
此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习， 掌握点样技术后再正式点样。
图3-6 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图 （虚线处为点样位置）
3、 电泳
用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的 滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支 架上，如图3-7所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直， 中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜， 则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜 平衡10min。
②经电泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95％乙醇（2:8） 溶液中20分钟，取出后将薄膜平贴于玻璃板上。干燥过 程中，薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计绘 出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数。 目前国内已有自动定量的光密度计生产。此透明薄膜可 长期保存，供教学示教用。
【 注意事项】
γ-球蛋白 6.85-7.50 -1.0×10-5
156000-300000
纤维蛋白元 5.40
-3.1×10-5
正常值：白蛋白57～72%
α2球蛋白4～9％ γ球蛋白12～20％
α1球蛋白2～5％ β球蛋白6.分析血清蛋白的正常结果不同于纸上 电泳，主要是白蛋白偏高，个别正常人白蛋白仅超过70 ％。Α -，α -，和β ，γ 都偏低，个别正常人γ 球蛋臼 可低到12％左右。上述正常值仅供参考。
② 血清蛋白染色
染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B， 加蒸馏水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR） 10mL，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。
漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR） 5mL和蒸馏水50mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。
③透明液：临用前配制。 甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，
取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜 吹干。
图 3-8 血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 图谱比较示意图
a.蛋白染色 b.脂蛋白染色
6、结果判断与定量
一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示5条区 带，其排列顺序见图3-8a，未经透明处理的电 泳图谱可直接用于定量测定。
可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组 分相对百分含量。
血清中含有清蛋白，α -球蛋白、β -球蛋白、γ -球 蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、 立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中 迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性 PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电 场中迁移速度快。
例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条 区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α 1-、α 2-、 β -及γ -球蛋白（如图3-5）。
【实验材料】
1．电泳仪 包括直流电源整流器和 电泳槽两个部分。
2．醋酸纤维素薄膜。

4 试剂
① 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6, 0.07mol/L, 离子强度0.06)称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g 巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约 600mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至 1000mL。置40C保存，备用。
蛋白质名表称3-1等2电点人血浆泳蛋动白脉质/(c的m2等·V-电1·S及-1)迁分移子率量
清蛋白
4.88
-5.9×10-5
69000
α1-球蛋白 5.06
-5.1×10-5
200000
α2-球蛋白 5.06
-4.1×10-5
300000
β-球蛋白 5.12
-2.8×10-5
9000-150000
用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分 别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源 开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流 强度为0.3mA（8片薄膜则为4.8mA）。通电10-15min 后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8 片共8mA），电泳时间约50-80min。电泳后调节旋扭 使电流为零，关闭电泳仪切断电源。
图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图
1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点
这些区带经洗脱后可用分光光度法定量， 也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带 吸收峰及相对百分比。
此法由于操作简单，快速，分辨率高及 重复性好等优点。它不仅可用于分离血 清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋 白及同工酶的分离测定。
图3-7 电泳装置剖视示意图 1.纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜
4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板
4、染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）
用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%氨 基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min，取出后 再用漂洗液浸洗脱色，每隔10min 换 漂 洗 液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。
滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为 滤纸桥。
③ 电极槽的平衡
用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极 槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15-20min。 注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。
2、点样
取一张干净滤纸（10×10cm），在距纸边1.5cm处 用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。
本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫 描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进 行定量。下面为后者的具体操作步骤：
取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4N氢氧化钠 4ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均 大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动， 使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波 长用650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋 白A、α 1、α 2、β 、γ 球蛋白各管的光密度。
⑴ 醋酸纤维素薄膜的预处理
薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片 漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度， 如漂浮15-30s时，膜片吸水不均匀，则有白色斑点或条纹， 这提示膜片厚薄不均，应弃去不用，以免造成电泳后区带 扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。
点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓 冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品 不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影 响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹污染， 取膜时，应戴指套或用夹子。
⑹透明及保存
透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发而 影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明 前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在 透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透 明度不佳。