２多酚氧化酶同工酶
中，通过不同程度地抑制或利用酶活，可加工成品 质与滋味迥异的不同茶类，尤其是在红茶加工过程 中能够催化氧化茶多酚类物质形成茶色素，以及酶 促偶联氧化香气前体物，从而对红茶的色、香、味等 品质作用显著［２＿３］。本文从ＰＰＯ结构分类、同工酶、分 离纯化方法、ＰＰＯ与茶叶品质关系及酶促合成茶黄 素等方面综述茶叶ＰＰＯ及其同工酶研究进展，以期
ｏｆ
Ｔｅａ
ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，
Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈｃｚ＿４１０１２８） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ
４多酚氧化酶与茶叶品质关系
尤其对提高红茶品质和减轻夏、秋季绿茶的苦涩味 具有特殊作用，被认为是一项投资少、效益高的制 茶新技术。Ｍｉｙｕｋｉｋｉｌ２０＿｜在红茶发酵时添加１％或揉捻 时添加０．００１％的微生物ＰＰＯ，结果缩短了红茶发酵 时间，茶黄素、茶红素含量明显提高，茶汤色泽和香
气明显改善。谭振初［２ｌ将茶幼果的ＰＰＯ酶液应用于
ｓｏｕｒｃｅ，ｅｔｃ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｅａ，Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ，Ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ，Ｔｅａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｉｓｏｚｙｍｅ
多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ，简称ＰＰＯ）是自 然界广泛存在的一种氧化还原酶，由铜离子辅基和 主酶组成，它能够有效的催化多酚类及其衍生物氧 化形成相应的醌类。在茶叶加工、果蔬酶促褐变、食 品医药、环境保护等方面具有重要研究价值和应用 前景［１］。茶叶中多酚氧化酶（邻苯二酚：０：氧化还原 酶，ＥＣ．１．１０．３．１）及其同工酶不仅对茶树生理代谢、
３多酚氧化酶结构
叶绿素、ｖ。等热敏陛品质成分，从而形成绿茶的“绿
汤绿叶”特征。近年来随着微波、超高压、干热风、远
红外辅助等技术用于绿茶杀青，对ＰＰＯ活性进行柔
性钝化，更有利于茶叶理化成分的保留和优良品质
的形成旧。在红茶加工中，萎凋、发酵工序在ＰＰＯ作
用下，利用自身系列酶促氧化反应，将儿茶素类物 质催化氧化形成茶色素类物质。在青茶加工中，ＰＰＯ 酶促氧化多酚类直接引起邻醌的偶联氧化作用，以 多酚类和相关色素形成作为“发酵”特征的化学反
ａｓ
ｏｘｉｄａｓｅ（ＰＰＯ）ｉｓ
ｅｎｚｙｎｌｅ
ｏｎｅ
ｏｆ ｔｈｅ
ｎｌｏｓｔ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｏｘｉｄａｔｉｏｎ—ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｎｌｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｔｅａ
ｔｒｅｅ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－ａｎｄ
ｃｕｒｒｅｎｔ
ｔｅａ
ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，
ｔｈｅ ｋｅｙ
ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ
得了电泳纯制品，酶比活力为５００７５．４３Ｕ／ｒａｇ，纯化 倍数达到５９７．９９，回收率０．４８％。Ｊｉｎｓｅｎ Ｘｕｌ２５１采用丙 酮粉法提取板栗ＰＰＯ粗酶，经６０％硫酸铵沉淀、透
万方数据
第２期
滕杰等：茶叶多酚氧化酶及其同工酶的研究进展 茶叶多酚氧化酶对茶叶品质形成至关重要，关 系到茶叶适制性，一般ＰＰＯ含量高、活性强的茶叶 适制红茶，反之适制绿茶。在绿茶加工中，通过高温 杀青破坏酶活性，使成品茶保留较多的茶多酚类、
环境条件、提取方法及ＰＡＧＥ电泳技术有关。王坤 波［９］发现不同来源的ＰＰＯ同工酶在酶带数目、Ｒｆ值 及分子量均有差异，梨的同工酶有１１条，茶叶２ 条，蘑菇５条，苹果４条，漆酶１条。ＰＰＯ的同工酶 酶谱中，一般存在７、８条，多的可达１０条，少的仅 有１、２条。通过ＰＰＯ同工酶可探讨茶树的起源、品 种的早期鉴定、酶促合成茶黄素组分、茶叶加工中 同工酶变化与品质的相互关系等［６１。大多数茶叶 ＰＰＯ同工酶能催化绿原酸氧化，对表没食子儿茶素 没食子酸酯、邻苯二酚氧化尤为显著［７１。刘仲华ＩＳ］从 茶鲜叶中分离出六条同工酶，按照迁移率由小到大 排列依次命名为ＰＰＯ。～ＰＰＯ。，其中ＰＰＯ：、ＰＰＯ。、ＰＰＯ。 对多酚类敏感性较强，其他则相对较弱，酶促氧化 儿茶素各同工酶所起作用也有所差异。ＰＰＯ同工酶 与茶树新梢的发育、代谢也有联系，并能反映新梢 各部位的生理代谢差异与芽叶老化程度。通过茶树 抗逆性与新梢中酶系统多态性之间的关系研究认 为，多酚氧化酶在相对含水量５０％和１１０％时，比 ７０％和９０％时多出现一条新的同工酶，由此推测出 现这种变化可能与茶树的抗旱、抗湿性有关［１０］。
万方数据
１２
第４１卷
酶粉活性尚可、体积小和便于贮存，可直接应用。缓 冲液匀浆液提取活性得率较高，但酶液本身活性较 高，不利于酶的应用，尚需进行浓缩、提纯才能达到 应用要求。另证实丙酮粉法与匀浆法相结合的方法 提取效果更佳。
５．２分离纯化
果、漆酶、蘑菇。在不同品种梨中，丰水梨ＰＰＯ酶活 性最高，合成茶黄素的能力最强。并发现它存在６ 个同工酶，各同工酶比整个酶复合体对底物的专一 性更强，对各种儿茶素或简单酚类的催化氧化速率 不同。因此，获取廉价高效的不同ＰＰＯ酶源用于酶 促合成茶黄素及其组分的制备将会受到更多关注。
ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｔｈｅ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ｔｅａ ｑｕａｌｉｔｙ－ｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰＰＯ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＯ ｅｎｚｙｎｆｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｎ
Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ Ｓｈｕｏ，ＱＩＮ Ｙｕ，ｕＵ
Ｉｓｏｚｙｍｅ ｏｆ Ｔｅａ
Ｗｅｎ－ｊｕｎ８
ｒＩＥＮＧ Ｊｉｅ，ＦＥＮＧ Ｊｉｎ—ｙｕ，ＸＩＯＮＧ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｋｕｎ—ｙａｎ，ＧＯＮＧ Ｚｈｉ—ｈｕａ，ＸＩＡＯ
ＰＰＯ酶促合成茶黄素条件优化 多酚氧化酶酶促反应条件一般受温度、ｐＨ值、
时间、儿茶素组成及浓度、溶氧、酶浓度等因素影 响。在不同体系酶促反应条件下，优化最适反应体 系参数对于获取不同茶黄素组分切实可行。Ｈｉｌｔｏｎｌ３０Ｊ 研究鲜叶中Ｌ—ＥＧＣＧ和Ｌ—ＥＣＧ在一定量的基础 上，Ｌ—ＥＧＣ的含量与ＴＦ的生产量成高度相关，在制 茶中若能增加Ｌ—ＥＧＣ等非酯型儿茶素含量，将使 ＴＦｓ生成量增加，这不仅说明底物浓度对ＴＦｓ总量 的影响，而且也表明了儿茶素单体问不同比例对茶
应被控制在鲜叶局部和一定的变化范围内进行，形
成青茶“绿叶红镶边”特征。在黑茶加工中，湖南农 业大学［１８．１９］发现ＰＰＯ活性由高到无又到活性呈现的 变化规律，通过系统研究加工过程中的ＰＰＯ同工酶 酶带，表明后出现的ＰＰＯ来源于渥堆工艺中微生物 代谢活动分泌的胞外酶，而正是这种胞外酶的作用 铸就了黑茶特有品质。在黄茶和白茶加工中，ＰＰＯ 不同程度的参与催化反应，从而形成各自品质特征。 随着现代生物技术的发展，外源生物酶的添加 技术在茶叶领域中得到良好运用。大量研究表明采
黄素总量也有极大的影响。以儿茶素混合物Ｃ
ｆＥＧＣ＞２００ ｍｇ／ｇ，ＥＧＣＧ＞２００ ｍｇ／ｇ，儿茶素总量＞
Ｓ－２００、羟基磷灰石和
ＦＰＬＣ进行分离纯化，纯化倍数达到３１４，得率 ０．２３％。梁建荣［２ａｊ对甘薯叶采用匀浆法提取ＰＰＯ粗 酶，经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换
层析和Ｓｕｐｅｒｄｅｘ一２００凝胶过滤层析等纯化步骤，获
红碎茶加工，不仅提高红茶茶黄素含量，改善其鲜 强度，而且还为茶果的综合利用开辟了新途径。叶 飞［２２］利用砂梨中多酚氧化酶促进夏秋红茶发酵，使 红茶中苦涩味物质显著减少，同时甜醇类物质显著 增加，降低了５．１提取方法 无论是ＰＰＯ酶分子生物学还是酶工程技术研 究，都要从相应酶源中提取出粗酶液，并进行多级 分离纯化，获得目标纯酶，提取方法一般有丙酮粉 法、匀浆法和匀浆浸提法。综合比较发现丙酮粉法 对ＰＰＯ酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其
病害及机械损伤起重要作用，而且在茶叶加工过程
为茶树品种适制性评价、茶黄素及其组分高效制备 以及ＰＰＯ同工酶酶源筛选与利用提供科学依据。
１
多酚氧化酶的分类
多酚氧化酶是由核基因编码，在细胞质中合 成，通过特定的方式转运至质体内而成为具活性的 形式，具有底物专一性。根据多酚氧化酶催化底物 的不同分为问酪氨酸酶（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ，ＥＣ １．１４．１８．１）、儿 茶酚酶（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｓｅ，ＥＣ １．１０．３．１）、漆酶Ｌａｅｃａｓｅ，ＥＣ １．１０．３．２）、酚酶（Ｐｈｅｎｏｌａｓｅ）、绿原酸酶ｆＣｈｌｏｒｏｇｅｎｉｅａｅｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ）等。根据底物中酚羟基数目和位置差异又可 分为单酚氧化酶和双酚氧化酶，双酚氧化酶包含的 对苯二酚氧化酶和邻苯二酚氧化酶统称为多酚氧 化酶圈。
ＰＰＯ ｉｓｏｚｙｍｅ ｗｅｒｅ
ｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｃ ｆｏｒ
ｔｅａ
ｔｒｅｅ
ｃｕｈｉｖａｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ
ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＰＰＯ ｉｓｏｚｙｍｅ ｅｎｚｙｎｌｅ
第４１卷第２期 ２０１４年６月
茶叶通讯
ＴＥＡ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ
Ｖ０１．４１．ＮＯ．２ Ｊｕｎｅ，２０１４
茶叶多酚氧化酶及其同工酶的研究进展
滕杰丰金玉熊硕秦昱刘昆言龚志华
肖文军＋ （湖南农业大学园艺园林学院，茶学教育部重点实验室・长沙・４１０１２８）
摘要：多酚氧化酶（ＰＰＯ）是茶树生理与茶叶加工中的一类重要氧化还原酶，也是茶黄素及其组分酶促合成中的关键酶。从 ＰＰＯ结构分类、同工酶、ＰＰＯ与茶叶品质关系、ＰＰＯ分离纯化及酶促合成茶黄素等方面进行综述，以期为茶树品种适制性评价、 茶黄素及其组分高效制备以及ＰＰＯ同工酶酶源筛选与利用提供科学依据。 关键词：茶叶；多酚氧化酶；茶黄素；分离纯化；同工酶