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（六）革兰氏染色各步骤的要求
1、载玻片的要求
载玻片应清洁干净。 常规工作中可将载玻片清洗干
净后浸泡在95％酒精中，随 用随取。
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2、涂片的要求
滴一滴无菌水在载玻片中央， 准备涂片；或用接种环沾3-4 环无菌水，用于涂片。
无菌水不宜过多，否则后续的 干燥时间增多。
红色
2#
球状
紫色
结果判断 G-杆菌 G+球菌
报告：经镜检，该细菌为G-（革兰氏阴性） 杆菌。
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（五）操作注意事项
1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴生理盐 水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌
？ 膜宜薄。
2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 3、染色过程中勿使染色液干涸。 4、选用幼龄的细菌。
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（一）革兰氏染色流程
涂片 → 干燥 → 固定 → 染色 → 镜检
初染 → 媒染 → 脱色 → 复
结晶紫初染1min，水洗
染
碘液媒染1min，水洗
乙醇脱色20秒，立即水洗至无色
番红复染1min，水洗
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（二）革兰氏染色原理
革兰氏染色后镜检，显微镜下 观察发现，有些种类细菌呈红 色，有些种类呈紫色。
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5、涂片为什么要薄而均匀，不能过厚？
涂片过于浓厚，可能会脱色不 足，导致假阳性结果，菌量过 大也不利于菌体排列方式的观 察。
左下角，太厚而不能脱色
同理，不均匀也会在局部过厚， 颜色不一，难以判断。
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5、涂片为什么要薄而均匀，不能过厚？
过少可能难以观察到标本菌。
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一、单染色法
简单染色的基本程序： 涂片 → 干燥 → 固定 → 染色
→ 水洗 → 干燥 → 镜检
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涂片
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干燥 自然干燥；或者在酒精灯上方
稍微加热至干燥。 固定 过火焰2~3次。
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染色前必须固定细菌 其目的有二： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上
四、实验步骤
1、菌落形态观察： 2、细菌简单染色：
3、➢细注滴菌加意少革：量兰水菌氏落染颜色。色、湿度、形状、大小、透明度 、➢染颜色色过、程边：缘是否规则等特征。
➢涂片→干燥→固定→染色（1min）→水洗→
干燥→镜检
➢注意事项：挑取菌体
涂片
干燥
涂片：取菌量不能太大
干燥：自然干燥
固定 水洗：水流染色不能直Pa接ge 1冲2 在水洗涂菌1处2
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3、制作涂片时，菌落要符合什么要求？
革兰氏染色所用的应是不超过 24小时的培养物。
培养时间过长，阳性菌有部分 菌体老化，细胞壁不完整，染 色呈红色。
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一种菌两种颜色，难判断
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4、制作涂片时，菌落要符合什么要求？
革兰氏染色所用的应是单菌落， 不能取菌苔。如果挑取的菌落 /菌苔中多于一种细菌，结果 将难以判断。
金黄色葡萄球菌+大肠杆菌 革兰氏染色
3
微生物染色法的分类
单染色法：只用一种染料染色， 也称普通染色法。用于微生物 形态的观察。
革兰氏染色法：用两种或多种 染料染色，也称鉴别染色法。 用于微生物鉴别。
金黄色葡萄球菌 结晶紫染色
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金黄色葡萄球菌+大肠杆菌 革兰氏染色
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芽孢染色法 鞭毛染色法 荚膜染色法 霉菌染色法
二是增加其对染料的亲和力
常用的有加热和化学固定两种方法
固定时尽量维持细胞原有的形
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染色 以刚好覆盖菌膜为宜；放置几
分钟。 水洗 不能直接冲洗涂面；水流要小。
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干燥 室温自然干燥或吸水纸吸干
（只能按压，不能来回擦） 镜检 低倍 → 高倍 → 油镜
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强度 较坚韧
较疏松
磷壁酸 主要成分
无
肽聚糖网 较多，交联 较少，交联度
Hale Waihona Puke 层次致密差外膜
无
有
类脂
无
有
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细胞壁的差异带来的结果是什么？
细胞壁的成分、结构的差异带来了性质差异。 乙醇短时间浸泡，能破坏革兰阴性菌的外膜和部分细胞
壁；但对革兰氏阳性菌细胞壁破坏不大。
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细胞壁的差异使不同类细菌染上不同颜色
微生物染色技术
一、染色技术
为什么微生物要染色？
目的1： 强化观察对象与背景的反差
细菌透明，染色后才易于观察。
炭疽杆菌 酚复红染色
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金黄色葡马萄拉球色菌 结耳晶道紫未染染色色
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目的2： 微生物的鉴别、组织的形态观
察
如鉴别微生物属于革兰氏阳性还是 属于革兰氏阴性菌。
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各类型细菌 结晶紫染色
显微镜下无色 细菌被染上紫色
碘液媒染
颜色基本不变
乙醇洗脱 番红复染
有些细菌被脱色
脱色的细菌被染 上红色
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（三）染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果 24 Page 24
枯草芽孢杆菌革兰氏染色结果 25 Page 25
（四）结果记录报告
细菌 细菌形态 颜色
1#
杆状
操作练习
制作细菌涂片一个；并用显微 镜观察。
附步骤： 涂片 → 干燥 → 固定 → 结晶
紫染色1min → 水洗 → 干燥 → 镜检
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二、革兰氏染色法
革兰氏染色法是一种复染色法， 在微生物分类、鉴定、检测中 具有重要地位。
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临床鉴定细菌的步骤
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GB4789.3-2003大肠菌群检 测中，革兰氏染色是其中的必 要一步。
因此，革兰染色制片时菌量不
宜太多也不宜太少，涂片薄厚
应均匀一致。
过多
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适中
6、涂片范围为什么不能过大？
涂片范围过大，易造成颜色不一，难以判断。 原因：脱色后，难看清涂片范围，又因范围过大，复染
干燥
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曲霉的染色显微结构
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安全警示
1.加热固定时要使用载玻片夹子，以免烫伤。不要将 载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂
2.使用燃料时避免粘到衣服上 3.放线菌和霉菌制片要减少空气流动，避免吸入孢子 4.实验完毕后洗手，金黄色葡萄球菌为条件致病菌，
二甲苯为有毒物质。
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为什么呢？？？
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革兰氏染色后细菌呈不同颜色的原因是什么？
是细胞壁的差异！ 一些细菌的细胞膜外有一层细
胞壁；有些细菌的细胞膜外有 一层细胞壁，还有一层外膜。
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
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它们的细胞壁还有什么差异？
细胞壁 革兰阳性菌 革兰阴性菌
厚度 20～80nm 10～15nm