液体石蜡法
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件 下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个 斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行 保存的一种菌种保藏方法。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
❖ 操作步骤：
液体石蜡预处理 斜面培养物制备
将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种 长期菌种保藏方法。
准备冷冻管 准备保护剂 （ 10%-15%甘油） 准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液） 制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）
保藏（ -80℃，2～5年）
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
-80℃冰箱冻结法
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。
棉塞
打棉塞，160℃定型2h；
标签
激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。
真空干燥
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随 后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻 结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。
终止干燥时间应根据下列情况判断：
安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状 真空度接近空载时的最高值 样品温度与管外温度接近 选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为
退化 不易退化
保藏成本 高 较高 低 较低 高
操作性 简单 比较简单 复杂 复杂 复杂
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
菌种保藏技术进展
程序降温控制技术
冷冻速度慢：细 胞内水分外渗多， 细胞脱水，体积 收缩。 冷度速度快：细 胞内水分没有足 够时间外渗，细 胞内结冰。 冷冻速度非常快： 细胞内冰晶非常 小或称玻璃化状 态。
Teliospores : Puccinia spp。 Source: /~pi/enpp/p athology/images/dayl.
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
菌种保藏技术进展
❖ 包埋固定化技术
是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液 加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取 传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中， 并延伸至线虫和藻类。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
微生物菌种保藏
微生物菌种保藏方法
基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休 眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的 环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优 良特性。
基本措施是低温、真空、干燥。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
冻干样品制备
制备斜面培养物； 将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜
面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。 用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，
操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底 部，勿使菌液沾在管壁上。
对于1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107℃/秒时才 能实现“玻璃化”。
31
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
保藏菌株要求
药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内 或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标 准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。
2010版中国药典《药品微生物实验室规范指导原则》
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
国内认可的菌种收藏机构
1979年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种 保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设7个全国性菌种保藏 管理中心及机构所在地：
普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物研究所 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所 抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所 兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所 林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院
菌株代数
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一 次即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5 代”。
United States Pharmacopoeia (USP) provides that: "to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation," and provides that
干燥、低温、无氧、保护 剂
－80℃冰箱冻结法 低温(－80℃)、保护剂
超低温(－150℃或－196 液氮超低温冻结法
℃)、保护剂
保藏时间 3～6 月 1～2 年 8～10 年 2～5 年 10 年以上
保藏设备 冰箱
菌种活性 易退化
冰箱
退化
－80℃冰箱、真空冷冻干燥 机、封管设备
退化
－80℃冰箱 程控降温仪、 液氮运输罐及液氮罐
灭菌
121 ℃，30min.
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
保护剂的准备
保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管； 灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌
20min； 打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅
速放入凉水中冷却； 30℃培养2天，无菌检查合格后备用。
干燥完结
预冻
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h； 分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，
使菌液完全冻结； 可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30
分钟，再放入－80℃冰箱冻30min； 采用离心式冻干装置时勿需预冻。
❖ 使用方便； ❖ 保藏时间较长； ❖ 对设备要求高(-80℃冰箱)； ❖ 运输不方便。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
液氮超低温冻结法
指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃ 的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种 保藏方法。
操作步骤
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
冷冻管准备 保护剂制备 保藏培养物准备 预冻
同“－80℃冰箱冻结法”
— 将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温 速率降至-35℃； — 使用程序降温盒。
保藏
将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
"esxtcreaeinds5ofgethneerpaatisosnag. e“s (from the original strain from freeze-dried powder) must not
我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种 的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。
液氮超低温冻结法
❖ 保藏时间长； ❖ 保藏效果好，菌种不易退化； ❖ 对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平
要求高； ❖ 保藏成本高。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
不同保藏方法的比较
保藏方法 定期移植法
保藏原理 低温(4℃)
液体石蜡法
低温(4℃)、阻断氧气
真空冷冻干燥法
灌注石蜡 保藏
液体石蜡法
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
❖ 操作简单，使用比较方便； ❖ 对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；· ❖ 菌种易退化、污染。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
真空冷冻干燥法
指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经 预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存 后保存的一种长期菌种保存方法。
微生物保藏及基本操作技术
中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC 姚粟 博士
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
微生物菌种保藏
菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是 发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重 要生物资源。
菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种 的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏 的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌 种的污染或死亡。
Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. © M.Ryan / Mycologist 15: 66-69
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
菌种保藏技术进展
玻璃化技术
就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰 晶，一下子以“非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的 破坏作用。
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011