➢ 电激法：使重组核酸进入宿主细胞；
重组核酸的转化（动物细胞）
➢ 磷酸钙共沉淀法：核酸-磷酸钙共沉淀物，吸附细胞 膜被细胞内吞，用于瞬时表达和稳定表达；
➢ 二乙氨乙基葡聚糖（DEAE-葡聚糖法），用于瞬时 表达；
➢ 电击穿孔法：将细胞暴露在短暂的高压脉冲下，可 使细胞原生质膜形成纳米小孔；
➢ 原生质体融合法：转化成细菌，做成原生质体，再 将原生质体和细胞直接融合；
➢ 脂质法：进行脂质体包埋，然后脂质体与细胞膜融 合，进入细胞；
➢ 显微注射法：广泛用于转基因技术，主要用于转基 因动物；
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重组核酸的转化（植物细胞）
➢ 动物细胞转化方法也 可用于植物细胞转化。
➢ 基因枪法：微弹轰击 法，外源基因包裹在 金属粒上；
核酸的结构
➢脱氧腺苷酸 dAMP、脱氧鸟苷酸 dGMP、脱氧胞苷酸 dCMP、脱氧胸苷酸 dTMP ➢腺苷酸 AMP、鸟苷酸 GMP、胞苷酸 CMP、尿苷酸 UMP ➢甲基化稀有碱基，遗传信息的调控与保护；
核酸的结构
DNA和RNA
双脱氧核糖，DNA测序
DNA的结构
A C T GCT AAC 5' P P P P P P P P P OH 3'
➢ 启动子和终止子；启动子引导RNA聚合酶起始 转录，终止子，转录终止信号；
➢ 基因的调控与表达：见PPT
第二节：基因重组技术
重组的工具酶和载体 重组核酸的转化和筛选 PCR技术 如何克隆目标基因
重组技术基本步骤
切----接----转-----增---核酸内切酶命名
基因和DNA并没形成直接的联系
核酸承载遗传信息发现过程
肺炎双球菌转化试验
T2噬菌体实验
DNA是基因（遗传信息）的承载
DNA双螺旋结构的发现
四核苷酸假说：四种碱基数量相同，4个不同碱基组成的四核 苷酸连接而成； 1950年，奥地利生物学家查格夫法则：A和T相同，G和C相同； 1953年，沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构；
生物工程与技术导论
第五章 核酸与基因重组技术
核酸相关知识 基因重组技术 基因重组技术前沿 基因重组技术的应用
第一节：核酸的相关知识
核酸承载遗传信息 核酸的结构 基因的表达与调控
核酸承载遗传信息发现过程
1896年，瑞士生物学家，米歇尔分离出核素； 1935年，Kossel和Levene等对核酸的化学组成 进行了研究，分为DNA和RNA； 20世纪初，孟德尔碗豆杂交实验发现了遗传因 子，贝特森引入了“基因”概念； 1916年，布里吉斯通过实验证明了染色体是基 因的物质载体；
5' pApCpTpGpCpTpApApC-OH 3' 5' ACTGCTAAC 3'
核苷酸单位通过3',5'磷酸二酯键连接
5'-羟基磷酸和3'-游离羟基，具有方向性
DNA的结构
➢ 碱基在内（A＝T，G≡C） ➢ 三维构象，双螺旋结构、表面沟槽
（大沟、小沟）； ➢ 大沟一侧特定序列和蛋白结合起到
调控作用； ➢ 构成DNA核苷酸数量可达到百万个以
➢ S代表沉降系数,粒子的 沉降速度与粒子的大小 成比例；
➢ rRNA3'-端有一段核苷 酸序列与mRNA的前导序 列是互补；
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基因
基因是生命体的基本遗传单元
基因
➢ 编码区：编码遗传信息；非编码区：调控遗传 作息表达；
➢ 真核生物和原核生物编码区的区别，真核生物 含内含子和外显子，内含子：非编码序列；外 显子：编码序列；
上，编码的信息量也十分巨大；
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DNA的结构
➢ B型结构：右手 螺旋，一周为 10.5个核苷酸；
➢ A型结构：右手 螺旋，一周为11 个核苷酸；
➢ Z型结构：左手 螺旋，每转一周 为12个核苷酸；
B型最常见，A型不含水溶液中，z型可能起到调控表达的作用
DNA的结构
➢ 某些病毒和细菌的DNA的结构呈环形， 进一步扭转折叠形成超螺旋；
➢ RNA种类：mRNA、tRNA、rRNA、 hnRNA、snRNA、scRNA、miRNA 核酶；
RNA的结构
➢ 2'--OH的存在，导致 RNA 分 子 的 不 稳 定 ， 在碱性条件下容易断 裂；
➢ 2'--OH的存在，使得 RNA 分 子 可 以 形 成 高级结构，具有催化 活性，核酸酶、 tRNA三叶草结构；
➢ 真核生物染色体由DNA和蛋白质构成， 其基本单位是核小体；
➢ 吸收紫外线的特性，在260nm下紫外 检测器检测吸光度，解链增色效应；
DNA的结构
RNA的结构
➢ RNA和蛋白质共同负责基因的表 达和调控；
➢ 绝大部分RNA以单链形式存在， 也可形成局部的双螺旋结构；
➢ RNA的特点：结构更复杂、功能 更丰富。
mRNA
DNA模板转录而来，携带遗传信息到核糖体，指导蛋白 质合成。
tRNA
转运RNA二级结构，三叶草形 转运RNA三级结构，倒L形
tRNA
腺苷酸羟基可与氨基酸α羧基结合而携带氨基酸
rRNA
➢ 核糖体由rRNA和蛋白质 构成；
➢ 根据rRNA大小沉降系数 的不同，不同种类微生 物rRNA也不同；
限制性核酸内切酶
Taq:水生嗜热菌（Thermu saquatics） Eco:大肠杆菌 Hin:流感嗜血菌
限制性核酸内切酶
➢ I类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断部位 不定，切割点在识别位1Kb以上。
➢ II类限制性内切酶：严格识别, 特异性切割。 ➢ III类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和切点不
重组的工具酶和载体
载体
➢ Ori：代表质粒复 制起始位置；
➢ Amp：氨苄西林 抗性基因
➢ Mcs：多克隆位 点
➢ Lacz：常用标记 基因，编码的β一 半乳糖苷酶a受体；
β一半乳糖苷酶可使含有X-gal底物水解成蓝色产物
重组核酸的转化（细菌）
➢ 用CaCl2制备感受态细胞，羟基-钙磷酸复合物 粘附于细胞表面，42度热休克；
同，切割点在识别点下游10-24bp。
限制性核酸内切酶（II型）
限制性核酸内切酶（II型）
DNA连接酶
➢ DNA连接酶：将载 体DNA和克隆DNA 连接在一起的酶；
➢ DNA链必须是双螺 旋DNA分子一部分；
➢ T4 DNA连接酶，可 以连接平末端和黏 末端
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载体
载体的分类：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体； 克隆载体、表达载体