ｇｅｎｏｍｅ
来自ｍｉＲｅｃｏｒｄｓ数据库‘７ Ｊ，对生物信息学靶基因预 测采用目前公认的预测精度最高，且算法原理各异
的３种预测软件（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ，ＰｉｃＴａｒ，ｍｉＲａｎｄａ） ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）、ＰｉｃＴａｒ （ｈｔｔｐ：／／ｐｉｅｔａｒ．ｍｄｃ．ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／）、ｍｉＲｎａｄａ（ｈｔｔｐ：／／
Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ公司，美国）、Ｉ山Ｐａｒａｆｌｏ。”微流体心－４４－片（ＬＣ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司，美国）及ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ检测试剂 盒（ＡＢＩ公司，美国）。ｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ分离试剂盒 （Ａｍｂｉｏｎ公司，美国）。微样培育箱（ＨｙｂｅｘⅢ
ＭｉｃｒｏＳａｍｐｌｅ
Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＳｃｉＧｅｎｅ美国）、生物芯片扫
ｒｏｌｅ
ａ ｃｏｒｅ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｓ
ｎｏｔ
ｏｎｌｙ
ｗｉｔｈ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ｔａｒｇｅｔ—ｇｅｎｅｓ
ｃａｌｌ
ｂｕｔ
ａｌｓｏ
ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ
ｇｅｎｅｓ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ，ｍｉＲ－２２４
ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ
表达¨。２ Ｊ。ｍｉＲＮＡ在肿瘤中的重要调控作用，为我
们对肿瘤机制及诊治方面的研究开拓了一个新的方 向∞１。因此，我们试图通过本研究去寻找结直肠癌 中是否存在特定的ｍｉＲＮＡ，与其在肝脏等脏器中的 侵袭转移等过程有着何种相关联系，从而进一步研 究调控这种肝转移相关的特定ｍｉＲＮＡ本身及其上、
下游基因或转录因子的相关功能，以期为结直肠癌
癌肝脏转移ｍｉＲＮＡ对应的靶基因和生物信息学特征进行针对性分析。方法收集１０例伴有或不 伴有肝转移的结直肠癌患者肿瘤组织标本。应用ｍｉＲＮＡ芯片方法对两组样本的ｍｉＲＮＡ表达差异情 况进行研究，利用软件预测靶基因。进一步构建和分析肝转移结直肠癌相关的ｍｉＲＮＡ—Ｔａｒｇｅｔ转录调 控网络及基因本体论功能模块。结果芯片结果筛选出６种结直肠癌肝转移组较非转移组表达失 调的ｍｉＲＮＡ（上调的ｍｉＲ－２２４、ｍｉＲ一１２３６和ｍｉＲ－６２２；下调的ｍｉＲ．１５５、ｍｉＲ一３４２．５ｐ、ｍｉＲ．３６３）。最显著 上调的ｍｉＲ－２２４不但可以与其对应靶基因行使调控作用，而且可以与其他ｍｉＲＮＡ协同作用于其下游 的靶基因功能团，行使相应功能。结论ｍｉＲ－２２４作为调控网络的核心，可同时或异时性调控相关 的重要基因功能团，进而完成对结直肠癌肝脏转移的转录后水平操控，在肝转移过程中起重要作用。
作者单位：１０００３８北京，首都医科大学附属复兴医院普外科 通信作者：骆成玉，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｏｃｈｅｎｇｙｕ＠１６３．ｔｏｍ
万方数据
生堡普通窆Ｅ抖苤盍！Ｑ！！生！旦筮垫鲞箜！翅￡丛！』鱼！！！强：！！！坐！翌！Ｑ！！：！丛：！！：№：！
原发性结直肠癌患者手术切除标本１０例，其中 同时伴肝脏转移者５例，无远处器官转移５例，分别 构成肝转移组和无转移组，其中男６例，女４例；年 龄６６～８７岁，中位年龄７５岁；肝脏单发转移灶 ３例，多发转移灶２例，所有病例均在术前经Ｂ超或
ａ
ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ．Ｉｔ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｙｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．
ｖｉｔａｌ
分析软件：Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ２．５．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｔｏｓｃａｐｅ．
ｏｒｇ／）。 三、实验方法
１．提取总ＲＮＡ：使用ｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ分离试剂
盒抽提总ＲＮＡ。
２．ｍｉＲＮＡ微阵列芯片实验：ｍｉＲＮＡ微阵列芯 片采用ｐ。Ｐａｒａｆｌ０１Ｍ微流体芯片（ＬＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司）， 含最新版ｍｉＲＮＡ探针ｍｉＲＮＡ序列（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０ ｍｉｃｒｏＲＮＡ数据库，ｈｔｔｐ：／／ｍｉｅｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｓ．ｕｋ／
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ
３．０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司）；基因调控网络
芯片结果分析，将差异表达的ｍｉＲＮＡ与软件预测的 靶基因构成相互联系的转录调控网络，并按照 Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ的输入形式整理。进而将这种调控关系
用Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ进行可视化分析处理一。。 ５．靶基因的基因本体论（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ，ＧＯ）功 能分析：将靶基因列表输入ＤＡＶＩＤ服务器进行ＧＯ 分析，选取Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ作为分析和研究对
二、实验试剂及器材 １．主要试剂及仪器：ｍｉｒＶａｎａ
ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
验，将计算两种检测信号的比值（１０９：）。 ３．荧光实时定量聚合酶链反应（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ．ＰＣＲ）：挑选芯片结果中显著差异表达的ｍｉＲＮＡ （ｍｉＲ．２２４，即微小ＲＮＡ２２４）进行荧光实时定量
ＲＴ．ＰＣＲ的验证。采用ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ检测试剂
４０００Ｂ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
盒（ＡＢＩ公司）方法，按照试剂盒指定操作步骤进
行，应用ＰＲＩＳＭ ７０００型定量ＰＣＲ仪进行ＰＣＲ定量
描仪（ＧｅｎｅＰｉｘ
Ｄｅｖｉｃｅｓ公司，美
国）、实验室芯片（Ｌａｂ—ｏｎ—ａ－ｃｈｉｐ，Ａｇｉｌｅｎｔ美国）、
检测。采用小ＲＮＡ Ｕ４８作为实验的内参基因，进行 归一化。全部实验均重复３次。采用扩增曲线、溶 解曲线分析来检测ＲＴ．ＰＣＲ产物的特异性。采用 ２““‘方法计算ｍｉＲＮＡ相对表达量。６ ｏ。
ＣＴ作出诊断，并通过手术探查和术后病理确诊，均 未行术前放疗和化疗。
过微循环泵杂交仪器在ｐ，Ｐａｒａｆｌｏ。”微流体芯片上过 夜Ｈ１。使用Ｃｙ３和Ｃｙ５特异性荧光标记进行杂交 检测、用激光扫描仪（ＧｅｎｅＰｉｘ
４０００Ｂ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅ）采集杂交图象、Ａｒｒａｙ—Ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）软件对杂交图像进行数字化转换。数 据处理和分析首先是扣除背景，计算重复点平均值 和标准偏差，然后通过ＬＯＷＥＳＳ（１０ｃａｌｌｙ－ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）过滤进行标准化∞Ｊ。对于双色标记实
ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ
ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｌａｙｅｄ
ｍｉＲＮＡｓ（ｍｉＲ－２２４，ｍｉＲ一１２３６，ｍｉＲ－６２２）ａｎｄ ３ ｄｏｗｎ— ｍｉＲＮＡｓ（ｍｉＲ一１５５，ｍｉＲ一３４２－５ｐ，ｍｉＲ一３６３）．ｍｉＲ－２２４ ｗｉｔｈ ｍｏｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｒ
ｗｉｔｈｏｕｔ．Ｔｈｅ ｍｉＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ｍｉＲＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｎ，ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ．Ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ
・１１６・
生堡萱通处型苤查！！！！笙！旦筮垫鲞筮！塑些ｉ！』鱼塑！！垡：！！！些！型！Ｑ！！：！！！：垫：塑！：！
．基础研究．
结直肠癌肝转移相关靶基因转录调控网络的 构建及基因本体论功能富集分析
骆成玉
杨錾于德明
季晓昕赵新飞
【摘要】
目的研究结直肠癌肝脏转移微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）表达的差异及相关特性，并对结直肠
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）。总ＲＮＡ样品２～５斗ｇ通过ＹＭ一１００ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）微离心过滤柱得到片段＜３００ ｎｔ的小
象¨…。ＧＯ其实就是一个整合性的分类系统，通过 收集各真核生物（如ＳＧＤ、ＭＧＩ、ＦｌｙＢａｓｅ等）的基因 或蛋白质，利用已知的文献资料及序列比较资讯为 基础，将所有的真核生物的基因或蛋白质都基于在
ＬＡＳ３０００
Ｉｍａｇｅｒ（Ｆｕｊｉ，
２．生物信息学软件和网络数据库：ｍｉＲＮＡ序列 获取及其靶基因预测数据库：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇｙ／）、ＰｉｅＴａｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｅｔａｒ．ｍｄｃ— ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／）、ｍｉｒａｎｄａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／）、 ＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｓｕｍｍａｒｙ． ｊｓｐ）、ＫＥＧＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）、ＵＣＳＣ
ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＵＣＳＣ．ｅｄｕ／）；
ＧＵＩ
ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｓ／），取交集以最大程度地降低预
测假阳性¨。。 ｍｉＲＮＡ—ｔａｒｇｅｔ转录调控网络构建：基于ｍｉＲＮＡ
芯片数据图像分析软件：Ａｒｒａｙ－Ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ
Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）；Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ＰＣＲ分析软件：ＭｘＰｒｏ
ｃａｎｃｅｒ稍ｔｈ
ｌｉｖｅｒ
ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
ｔｗｏ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｍｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔＩｌｅｉｒ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ Ｔｈｅ ｆｒｅｓｈ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ＣＲＣ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ １０ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，
ｇｅｎｅ
ｒｅｌａｔｅｄ ｍｉＲＮＡ—ｔａｒｇｅｔ ｎｅｔｗｏｒｋｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｔｈ
ｎｏ
ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．