核酸分离纯化
RNA的去除
用不含DNA酶的RNase处理，使RNA降解。 添加RNase处理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽
提，离心除去蛋白质及寡核苷酸。
沉淀并吸附核酸
含DNA的水相可用1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水 乙醇沉淀。
基因组的大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中， 可用吸头将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉 淀附在壁上是荷电溶质或粒子在电场作 用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂 糖凝胶电泳。
不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电 泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同 的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离 后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。
纯度高：尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白 质、多糖和RNA等）。
得率好：选用合适的方法获得足够量的DNA。
三、基因组DNA提取的原理
准备适宜的材料
裂解细胞，释放DNA 核酸分离纯化
去除蛋白质、 RNA等杂质
沉淀并吸附核酸
核酸溶解（缓冲液）
细胞破碎
化学法、机械法、生物法
细菌—溶菌酶（降解细胞壁），EDTA（抑制 DNA酶，防止DNA降解），去垢剂SDS（破 坏细胞膜）
实验1 大肠杆菌基因组DNA 的提取与分离鉴定
理论介绍
一、内容提要
基因组是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。
为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从 不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内 的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程 度也不同。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，与蛋 白质结合构成染色体，原核生物的DNA不与任何蛋白质 结合。
酵母—破壁酶或液氮研磨
植物材料—液氮研磨（使细胞冻结，用研钵 碾制成粉状）
动物组织—匀浆或液氮研磨
核酸分离纯化
DNA与蛋白质的分离
1.DNA与蛋白质的分离
SDS：真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP，SDS能够破坏DNA与 蛋白质之间的静电引力或配位键，可使DNA与蛋白质解聚，释放 出DNA。
四、实验步骤
本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系 统提取细菌的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为新型材 料，能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其 他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。
五、琼脂糖凝胶电泳法测定DNA分子大小
详见实验课件：DNA的琼脂糖凝胶电泳
图1 E. coli JM109基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
简化操作步骤，缩短提取过程，避免物理、化学和生 物的因素对核酸的降解，如机械剪切力、高温和 DNase等酶，防止过酸、过碱，避免剧烈振荡和混合。
采用酚-氯仿抽提时应采用上下颠倒的方法充分混匀， 但动作要轻柔，离心分离两相时，应保证一定的转速 和时间。
沉淀DNA用的异戊醇、乙醇事先放入-20℃冰箱，待用 时取出。
CTAB：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复 合物，在高盐溶液（NaCl>0.7M）中是可溶的，当NaCl降低到 0.3M 时，可沉淀CTAB-核酸复合物。（植物）
2.蛋白质的去除
苯酚-氯仿-异戊醇：苯酚、氯仿能变性蛋白质，离心分层，DNA 溶于上层水相，变性蛋白质位于水相和有机相之间。异戊醇可 减少抽提过程的泡沫产生。
动物
小牛胸腺 肝脏
来源
植物 微生物
鱼类精子 幼苗 种子胚胎 谷氨酸菌体（ 7%~10%） 面包酵母（4%）
啤酒酵母（6%）
大肠肝菌（9%~10%）
许多病毒的DNA分子长度超过100kb，细菌DNA为 几千kb，高等动植物的基因组DNA长度达到上亿kb。
二、分离纯化核酸的总原则
保持基因组DNA结构相对完整：防止各种因素引 起的降解。
如果DNA沉淀量少或无法捞出，可离心获取沉淀。 沉淀DNA前，为提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸铵
等盐类促进沉淀。 获取的沉淀需再用70%乙醇洗涤除去残留的有机物、
无机盐等。
基因组DNA提取注意事项 使用新鲜、幼嫩的材料；材料应适量，过少造成核酸
提取量少，过多影响裂解，导致DNA量少。（推荐2-4 mL）。