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科研医学思路和方法作业

从MHCⅠ/Ⅱ类相关因子探讨针灸对带状疱疹的免疫逃避作用学号:12007076 姓名:李建伟专业:中医外科学(一)研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题1.研究内容课题以VZV免疫逃避机制中发挥着重要作用的感染病毒细胞免疫识别的MHCⅠ/Ⅱ类基因抑制为切入点,围绕IFN-γ和参与免疫逃避的的两条主要途径,有目的地观察IFN-γ和相关基因CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ的表达量、分布及变化规律,进一步检测CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA的表达变化以及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性的动态变化,并对上述指标的相关性及变化规律进行分析,说明调节VZV病毒感染的免疫逃避机制是针灸治疗带状疱疹、减轻疼痛和后遗症的关键。

且明确针刺与放血作用机制的差异所在。

主要开展以下工作:研究内容:(1)皮损组织病理学观察。

(2)镜检:外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞分类计数、巨噬细胞吞噬功能。

(3)流式细胞仪检测:外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。

(4)免疫组化法ABC染色法检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。

(5)western blot检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHC Ⅰ、MHCⅡ蛋白量的表达。

(6)RT-PCR法检测:皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA。

2.研究目标:2.2.1旨在明确针灸治疗带状疱疹,减轻疼痛和后遗神经痛,与调节MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的分布及表达关系,为针灸治疗免疫逃避类疾病提供科学依据。

2.2.2通过比较针灸与传统抗病毒药物的作用差异,为解决带状疱疹病毒耐药性问题提供理论依据。

2.2.3旨在明确针刺与放血在治疗疱疹作用机制中的差异。

3.拟解决的关键性问题:针刺放血对MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的调节与其有效干预VZV病毒免疫逃避机制的关系。

(二)拟采用的方案及可行性分析1.拟采用的方案实验环境:实验室相对封闭,自然采光,环境温度控制在20℃~25℃之间,湿度控制在60%左右。

实验动物:清洁级昆明种小鼠,体重22~24g,笼养,自由饮食,由上海市实验动物中心提供全价动物颗粒饲料。

1.1分组及造模:第一次实验采用大鼠192只,按照体重分层随机,分为6组,每组8只,在造模完成后开始治疗,连续7天,隔日(第1、3、5、7天)处死一批,动态观察针刺放血对大鼠VZV病毒初感染的影响;第二次实验在造模后30天开始治疗,观察针刺放血对大鼠VZV病毒潜伏、复发的影响,其他处理同上,第7天处死取材观察;造模:腹腔注射VZV8805株系病毒,按照100TCID50/0.1ml病毒量接种细胞,感染后48小时,模型即成。

模型组:造模方法同上,每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定,连续7天。

药物组:造模方法同上。

左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d,连续三天,每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定,连续7天。

针刺组:造模方法同上。

按照造模时间的先后顺序,在造模完成后,开始针刺,进针0.2~0.3mm,平补平泻,留针10min,每日1次,连续7天。

放血组:造模方法同上。

按照造模时间的先后顺序,使用皮肤针沿皮损和脊神经叩刺,连续7天。

针刺加放血组:方法同针刺组和放血组,治疗连续7天。

正常组:腹腔注射同体积生理盐水。

每天陪同模型组、针刺组、艾灸组固定,连续7天。

1.2 取材方法:造模结束后,在模型组40只中随机处死8只,取材检测VZV对对小鼠相关指标的影响。

针刺组、放血组、针刺加放血组、药物组、正常组在治疗后的第1、3、5、7天随机处死8只小鼠取材。

取材放入-80o C低温冰箱保存、备检。

1.3穴位选取:固定小鼠方法:根据小鼠的形体,在木板上钉上四个适当距离的铁钉,将夹子套在铁钉上,用夹子夹住小鼠的四肢以做固定。

小鼠穴位定位参考《实验针灸学》,模拟小鼠的定位方法:“大椎”在第七颈椎与第一胸椎间;“膈俞”在第七胸椎下两旁肋间,左右侧各一穴;“合谷”在在手背,当第二掌骨桡侧的中点处,“曲池”在在肘横纹外侧端,当尺泽与肱骨外上髁连线中点,“委中”在在腘横纹中点,当股二头肌腱与半腱肌腱的中间,“尺泽”在在肘横纹中,肱二头肌腱桡侧凹陷处。

1.4 观察指标及方法:1.4.1皮肤组织病理切片1.4.2镜检:外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞分类计数各组小鼠每天定时,专人割尾静脉采血10μl,加入0.38ml的白细胞稀释液中,摇匀,静置3分钟,光镜查外周血有核细胞、白细胞数和淋巴细胞、巨噬细胞分类计数;1.4.3流式细胞仪检测:外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。

①制备样品:处死动物,离心,收集细胞悬液,滴加特异性免疫荧光抗体,用流式细胞仪上机检测并进行分选。

②流式细胞仪检测:将分选细胞清洗、离心(1500RPM,10min),清洗两次,弃上清;加入PI荧光标记抗体;用流氏细胞仪分别检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。

③分析方法:测出的数据经PHOENIX公司分析软件Multicycle处理,得出细胞各周期的CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞相对含量和百分数,并绘出DNA分布的直方图。

1.4.4免疫组化法ABC染色法检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。

①制备样品:处死动物,取股骨骨髓,10%福尔马林固定标本,石蜡包埋,4μm厚切片。

②免疫组化染色检测方法:鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(DO-27)(武汉博士德(NeoMarker 生物有限责任公司,浓度1:50);鼠抗人cyclinD1单克隆抗体(DCS/6)福州迈新公司,浓度1:100);鼠抗人单克隆抗体CⅡTa 、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ(晶美公司);S-P免疫组化试剂盒(北京中山公司)。

ABC法:用0.1 mol/L PBST洗,切片与0.1mol/L PBST(含0.5%H2O2)作用30 min,用0.1mol/L PBST 洗,10 min×3次,与一抗4℃温育,用0.1 mol/L PBST洗,10 min×3次,与二抗(1:1000稀释)室温作用2 h,用0.1 mol/L PBST洗,10 min×3次,与ABC(1:2000稀释)室温作用1 h.用0.1mol/L PBST洗,10 min×3次.在DAB溶液中反应,用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液终止反应,用包被有明胶的玻片固定、水洗,用系列浓度乙醇(70%1次,80%1次,90%2次,95%2次,100%3次,每次5 min)脱水,二甲苯中透明,封边。

③分析方法:IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ免疫组化阳性信号均为棕黄色细颗粒状,染色结果按阳性细胞百分比及染色强度综合记分作半定量分析。

1.4.5 western blot检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHC Ⅰ、MHCⅡ蛋白量的表达。

①制备样品:取样品1×106~1×107细胞,PBS清洗,去PBS加0.1~1ml 总蛋白抽提试剂抽提总蛋白;使用KCTMBCA蛋白质定量试剂盒,测定样品浓度。

②方法:变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE);蛋白质转移到硝酸纤维膜,30mA恒流,4°C转移,过夜;膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时,加入一级抗体室温孵育1.5小时;加入HRP标记的二级抗体,室温孵育1小时;化学发光法检测,X胶片曝光显影。

③分析方法:扫描图片,用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化;将目的蛋白灰度值除以内参GAPDF的灰度值,校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

1.4.6 RT-PCR法检测:皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA。

①提取总RNA:取标本,用试剂(GIB-CO公司,美国)提取总RNA,溶于无RNA酶的灭菌超纯水中,用紫外分光分度计测定总RNA的浓度和纯度,同时琼脂糖电泳观察其完整性。

将RNA稀释成1mg/L,-80°C保存。

② MHCⅠ、MHCⅡ和β-actin引物序列CⅡTa: 5′-ACTCGATATCATTCCGGCAGACCTGAAGCAT-3′5′-GCTCACTGCC-CCAGCCCAATA-3′MHCⅠ: 5’- TGTCCCGGCCCGGCCTCGGG-3’5’-TCTCAGCAGGGTAGAAGCTA- 3’MHCⅡ: 5’-ACCAACGGGACGAGCGCAT-3’5’-CAAGCCGCCGCAGGGAGGTG-3’β-actin: 5’- AACGGCTCCGGCATGTGCAA - 3’5’-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3’PCR反应体系30μl,转录产物3μl,2U Taq DNA聚合酶,10mmol/L 4×dNTP 2μlPOLβ和β-actin引物。

反应条件:94°C预变性;94°C 50s,55°C 55s,72°C 60s,72°C 10min共30个循环。

③分析方法:产物经SYNGENE凝胶成像系统分析,以目的基因和β-actin 积分灰度值的比值,作为目的基因mRNA的相对表达量。

研究路线3.可行性分析:1、本人针灸专业硕士、中医外科皮肤病方向在读博士,多学科背景保证实验研究按计划进展并不断推向深入。

2、前期大量的临床实践和文献回顾性研究显示出针刺放血可改善VZV感染机体免疫功能;3、研究思路清晰,目的明确,有成熟的理论指导,所选指标针对性强,研究方案可行,研究方法及技术路线成熟;4、实验室的软件、硬件设备完全具备科研条件。

上海中医药大学实验室条件先进,课题所需仪器设备均已具有,所需试剂、抗体均可购买。

5、课题组成员层次结构、知识结构合理,有较强的科研能力和团结协作精神。

4.本项目的特色与创新之处1、首次开展针灸对VZV免疫逃避机制的研究,进一步揭示针灸改善调节VZV感染机体免疫功能的的分子生物学机制,也为针灸治疗病毒感染的相关疾病提供了理论依据。

2、通过研究针灸对带状疱疹后遗神经痛的调节机制,促进临床药物、针刺放血等多种疗法相结合,提高临床疗效,更具实际意义。

3、首次探讨针刺与放血疗法在改善VZV感染机体免疫功能中的差异,为两种疗法治疗不同病理的相关疾病提供实验依据。

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