μLC－ESI-MS
IMAC
二、磷酸化蛋白质分析的概述
双相磷酸多肽谱图 2D—PP
多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一 块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的 磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测
此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷 酸化状态的重要信息
(1)磷酸化位点的最大数目 (2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸
第六章 蛋白质翻译后修饰的鉴定
蛋白质翻译后修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的 作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为 完善，调节更为精细，作用更为专一 N-端fMet或Met的切除 二硫键的形成 化学修饰 剪切
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫 应答和应激反应等生理过程起着重要作用
方法
反相液相色谱（PR-HPLC） 免疫沉淀 固相金属亲和色谱 金属氧化物/氢氧化物亲和色谱 离子交换和等电聚焦
免疫沉淀
原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用 被保留了下来
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来
样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）
制备型2D胶电泳
分析型2D胶电泳
考马斯亮蓝染色
转印到膜
磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质
图谱比较
找出相应的磷酸化蛋白质
染色—得到全部蛋白质点
磷酸化蛋白质鉴定
四、蛋白质磷酸化位点的分析
1、磷酸肽的分离和富集
分离浓缩分析物，提高信噪比 如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那
和谷氨酸的酰化 丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化
=1800：200：1
被磷酸化修饰的蛋白
改变所带的电荷 改变催化基团的性质 改变蛋白质的构象 改变蛋白质的亚细胞分步 蛋白质功能变化的多样性
蛋白质磷酸化研究有三个主要目的
(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白 质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能
蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团 从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生 物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的 传递过程中占有极其重要的地位
蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上的过程
蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用
(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶 (3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋 白质组学研究的关键技术之一
细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的 表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部 分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白 质其磷酸化的部分仅占其总量的10%
么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组 分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的 比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量 放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同 时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化 肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测 和分析低丰度磷酸肽
1、磷酸肽的分离和富集
磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段 很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸氨基酸 分析
体外 pmol 32p蛋白标记
蛋白质分离 蛋白酶切 2DPP作图
体内 fmol 32p细胞标记
相关分析
蛋白酶切 2DPP作图
μHPLC
μLC－ESI-MS或 MALDI-MS
化的相对化学计量 (3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性
的相对状态
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式 的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质 谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化 肽段的信号强度要低很多
磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷 酸化蛋白鉴定要困难的多
在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点 胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的 酶“活性”
对外界信号具有级联放大作用 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信
号的持续反应
磷酸化类型
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化 精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸
已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗 体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝 氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有 空间障碍,所以抗体的结合力较差
免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集 目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋 白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨 酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收 缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过 程
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的 复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作 用
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常 关键的作用
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关
第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定
局限性
磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质 不能标记组织样本 放射性污染
2、抗体免疫印迹检测法
通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反 应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用 的方法
在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化
三、磷酸化蛋白质的检测
32P放射性标记法 抗体免疫2 P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测 方法
放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化 蛋白质
培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的 细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的 标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标 记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激 酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化