图l 基因工程操作流程
一.基因克隆 ( 目的基因。所谓目的 基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增 和表达的特定基因或DNA片段，能编码某
一产物或某一性状。获取目的基因 有三个途径：
1.从生物基因组中分离纯化（鸟枪法－ shotgun）：原核细胞DNA遗传背景不清。
基因工程（gene engineering） 或称重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指将获取的目的基因片段在 体外与载体DNA通过人工剪切、编接构成 DNA重组体，将其导入受体细胞并使之无性 繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目
的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变 生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程.
G or C at end
4. Primers should have approximately equal melting
temperatures
5. Avoid repetitive sequence( internal hairpin
structures)
6. Aim for 40-60% G+C content 7. Avoid complementarities within or between
基因工程 基本原理 及技术
基因克隆(gene cloning )：是指目的基因 与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体 细胞内进行复制、扩增（也包括目的基因
的无细胞扩增-PCR）的技术。
基因表达(gene expression)：是基因的转 录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到
蛋白质的传递和实现。
Primer Design Is Vital
1. Primers should usually be 18-25 bases long 2. Need as much sequence information as possible
outside target
3. 3’ end of primer is most important: best to have
Anneal primers Extend primers
Round 1
The exponential amplification of the gene in PCR
The first 4 cycles of a PCR reaction in detail. In the 3rd cycle two double strands of the right length are copied(the forward and reverse strand are the same in length).In the 4th cycle, 8 double strands of the right length are copied.
25 or 50µl in a micro Eppendorf(0.5ml) tube
COMPONENT
VOLUME
10×PCR buffer
5 µl
10×dNTPs(2mM)
5 µl
Forward primer(10pmols/µl ) 5 µl
Reverse primer(10pmols/µl ) 5 µl
Principle of PCR
DNA polymerase use single strand DNA as template to synthesize new DNA in vitro,(dNTP;Buffer;Mg2+,Primers)
Chain reaction: Repeated cycles of reaction under the same condition.
The PCR reaction
Denature 95ºC
Extend Primers
72ºC
Anneal Primers 45-68ºC
template Primers, dNTPs, Taq polymerase, Mg2+
What do we achieve by cycling temperature in the presence primers, dNTP, Taq polymerase?
Genomic DNA template
2 µl
Thermostable polymerase (2U/ µl )
H2O( to 50 µl Final volume)
primers
8. Can modify 5’ ends to add restriction sites etc
TA Cloning Of PCR Products Requires “A” s
A PCR
product
A Taq- yes
Pfu- no
pGEM-T pCR 2.1-TOPO
Typical Reac某一蛋白质的氨基酸序
列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序 列，随后应用化学合成法，就可在短时间内 合成目的基因。
用于结构清楚、分子量较小的基因
3.酶促合成法-反向转录法：这种方法 主要用于分子量较大而又不知其序列 的基因. mRNA→逆转录→ cDNA做目 的基因 。可PCR法合成。
Optimum condition of PCR
•Correct sources of template DNA • Best temperature select in three steps • Appropriate primers in both end • Others: Mg2+; Inhibitor……et al.
基因工程基本步骤
目的DNA 制备；载体DNA选择 ↓
DNA体外重组技术 ↓ （ DNA酶切实验、
连接实验）
重组DNA的转化（转染）试验 ↓
重组克隆的筛选与鉴定 （重组体的表型筛选，指纹图谱法，
PCR方法，探针杂交法 ）
↓ 目的基因表达产物的筛选与鉴定 （遗传互补法，免疫化学法－Western印杂 交法，微细胞法(microcell method)