SNP
数据库中筛选
的 检 测 方 法
24/50
SNP检测－SNaPshot
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SNP检测－SNaPshot
单引物扩增
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SNP检测－ SNaPshot
多重PCR: multiplex primers extension arrays
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SNP检测－突变错配扩增检验
共显性标记
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RAPD
实验流程
DNA提取 PCR扩增 产物检测 数据记录
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RAPD
很难判断带的有无 背景影响严重 Ｑ：带的亮度差异很大？ 凝胶分辨率？
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RAPD
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RAPD
阴性对照出带 阳性对照 where
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RAPD
反应体系


Buffer Mg2+ dNTP DNA 聚合酶 引物 DNA H 2O
AA
共显性标记的应用
Aa
花柱卷曲性的适应意义
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显性标记的应用
种群遗传多样性和 遗传结构
p0
p1
1
1 2 i
2
3
4
5
6
1
1 1
0
1 0
1
1 0
1
1 0
1
0 1
H随机扩增与特异性扩增
可重复性 —— 数据的可靠性
有条带 特异性扩增 非特异性扩增
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SNP
SNP变异来源

转换 transition
一种嘧啶置换另一种嘧啶 C↔T
一种嘌呤置换另一种嘌呤 A↔G

颠换 transversion
嘌呤与嘧啶互换，C↔A，A↔T等

缺失/插入
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在已知 DNA 序列 Polybayes 计算法 SNP pipeline 温度梯度凝胶电泳 以 DNA 构象为基 础的方法 变性梯度凝胶电泳 单链构象多态性 变性高效液相色谱检测 SNPs 检测 分析技术 基于酶切或 PCR 的方法 直接进行 DNA 测 序的方法 以杂交为基础的 方法 毛细管电泳方法 限制性片段长度多态性 随机扩增多态性 突变错配扩增检验 测序 SNaPshot 等位基因特异寡核苷酸片段分析 基因芯片技术 毛细管电泳技术
Mg2+浓度较高 核酸外切酶活性较低 单引物，序列短 纯度，浓度 纯度
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RAPD
反应条件

94℃ 36℃ 72 ℃ 引物退火温度太低 循环次数
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RAPD
阴性对照
阳性对照
可重复性
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RAPD
数据记录
0 – 1矩阵 显性标记
有 有 １ 有 无 １ 有 有 １
１
０
１
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无条带
扩增成功
扩增不成功
扩增成功
？
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随机扩增 RAPD, ISSR, 单核苷酸突变检验 SNP 限制性酶切 RFLP, PCR-RFLP, TRFP
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RFLP
RLFP
restriction fragment length polymorphism
原理
限制性内切酶消化获得的DNA片段大小的 变异
实验流程

DNA提取


目的片段扩增 （1 – 3 kb, < 30kb）
限制性内切酶消化


电泳分离
EB染色或银染
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PCR-RFLP
目的片段扩增

长度 来源
Barnes 1994 PNAS nrDNA, cpDNA, or mtDNA
酶切位点
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PCR-RFLP
Bsp1286I ScaI
cpDNA PCR-RFLP
S1 S2 S3
S1 S2 S3 S1 S2 S3
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Ordered data vs. Unordered data
Ordered data DNA sequences data
S1 S2 S3 S1: 5’ – GGATCATGTCTGACAGCTACTGGTAATG – 3’ S2: 5’ – GGATTATGTCTGACAGCTACTGGTAATG – 3’
RAPD
缺陷
可重复性低
显性标记
13/50
RAPD
RAPD
random amplified polymorphic DNA 10碱基 Williams et al. 1990
AP-PCR
arbitrary primer PCR 20, 30碱基 Welsh et al. 1990
DAF
DNA amplification fingerprinting 5, 8个碱基 Caetano-Anolles et al. 1991


近千种已用于商业流通

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RFLP
放射自显影检测

为什么要采用放射自显影检测？

Southern 杂交
探针？
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RFLP patterns in P. densata
41/50
RFLP
显性标记 or 共显性标记
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PCR-RFLP
S3: 5’ – GGATTATGTCTGACAGCTAGTGGTAATG – 3’
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Ordered data vs. Unordered data
Unordered data
RAPD, ISSR, AFLP
Unordered data 不适合用于构建系统发育树 和分子系统地理学分析。 能够衡量种群遗传多样性水平，基于种群间 遗传距离构建UPGMA或NJ树。
Joshi et al. 2000 Theor Appl Genet 100:1311
19/50
ISSR
20/50
ISSR
可重复性高于RAPD 随机扩增 显性标记
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SNP
SNP
single nucleotide polymorphisms 5’ – GGATCAGTACTGACTCAG – 3’ 5’ – GGATCAGTAATGACTCAG – 3’

DNA提取

目的片段扩增 （1 – 3 kb, < 30kb）
引物末端荧光标记， FAM


限制性内切酶消化
毛细管电泳分离

测序仪自动检测分析
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TRFP
48/50
Ordered data vs. Unordered data
Ordered data：能够从现有基因型或者 haplotype (多位点基因型)推测祖先型的数据
DNA分子标记
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随机扩增 RAPD, ISSR, 单核苷酸突变检验 SNP 限制性酶切 RFLP, PCR-RFLP, TRFP
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RAPD
RAPD
random amplified polymorphic DNA Williams et al. 1990 原理：随机扩增 引物：任意序列的10个碱基的寡核苷酸 片段 模板：未知序列的基因组DNA
780bp 470bp 310bp
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RFLP研究的发展
基因组DNA 酶 切 对 象 RFLP
PCR产物
PCR-RFLP
末端荧光标记 的PCR产物
TRFP
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RFLP
实验流程

DNA提取 限制性内切酶消化 电泳分离 放射自显影检测
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RFLP
限制性内切酶的选择

已经分离鉴定了数千种
RsaI
MboII
HincII
RsaI
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Identification of rice genomes by PCR-RFLP of Adh genes
Ge et al. 2001. Genome 44: 1136-1142
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TRFP
Terminal restriction fragment patterns 实验流程
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17/50
18/50
ISSR
50 mM of KCl, 1.5 mM of MgCl2, 0.25 mM of dNTPs, 2% formamide, 0.2 μM of primer, 0.5 mM of spermidine, 0.8 U of Taq DNA polymerase enzyme (Banglore Genei, India) and 20 ng of DNA per 25μl reaction Initial denaturation for 5 min at 94°C, each cycle comprised 1-min denaturation at 94°C, 45 s annealing at 49°C, 2-min extension at 72°C with a final extension for 5 min at 72°C at the end of 45 cycles. Most of the patterns with extremely good polymorphism and useful information were often accompanied with a background smear. To reduce this smear, 2% formamide was used in the reaction. All the patterns generated were repeated at least three times in order to obtain reproducible data.