3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
第二个循环 4个拷贝
3’
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’
5’
3’
3’ 3’
第三个循环 8个拷贝
3’
第n个循环 2n个拷贝
PCR反应体系
参与PCR反应的主要成份:
模板、引物、 dNTP 、 Taq DNA 聚合
各种类型病理性突变的比例
无义突变和移码突变：
稀有的错义突变：
60％
微小突变
20％
DNA大片段缺失或重复: 20％
基因突变分析所用实验材料
临床样本取材：

实验应用材料：




外周血 组织 毛囊 颊粘膜脱落细胞 羊水细胞 绒毛
DNA RNA Protein
RNA 的优点与缺点
2 3 4 5
1
5. 成人型多囊肾


是一种最常见的单基因遗传 性肾病，发病率约为1/1000 其主要特征在双肾形成进行 性增长的多个液性囊肿，最 终可引起肾衰竭 具有遗传异质性，存在两个 主要的致病基因PKD1和PKD2
46
ADPKD分子遗传基础
Gene PKD1 PKD2 PKD3 ?
Chromosomal locus



CMT是一类周围神经系统遗传病 ,其遗传方式 可为常染色体显性遗传(AD ,占绝大多数) 、常 染色体隐性遗传(AR)及 X连锁显性遗传(XD) 依据病理和电生理特点分为两型:脱髓鞘型 (CMT1 型) 和轴突型 (CMT2型). CMT1型约占 CMT总数的70%，70%以上CMT1由PMP22基 因重复引起 其中X连锁显性遗传CMT致病基因为CX32，含 有2个外显子
PCR反应的特点




特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 2～4 小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板
PCR反应原理和反应过程
DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 C ~95 C 退火（annealing）: 40 C ~70 C 延伸（extension）:72 C
若X染色体在Xq27.3处呈现细丝样结构， 且连接的末端形似随体，这条染色体就 被称为脆性X染色体。 主要临床症状：智力低下、语言障碍、 性格孤僻、伴有特殊面容——长脸、方 额、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可见 明显大于正常的睾丸。 通贯掌、三叉点C缺如。

Xq27.3
前突变和全突变
正常 CGG <6-54
新致病基因的研究方法 和技术
研究对象不同，策略方法不同

家系连锁分析来定位: 适于分析较大的遗传病家系，不适于 散发病例和小家系病例 二代测序技术： 适于散发病例和小家系病例

连锁分析与二代测序相结合加快新基因的发现
定位克隆
Met A A Met Val
Ser
Leu Gln Pro
T G G T C T C A C T G C A A C C G
酶和缓冲液等。
引物(Primers)
引物决定PCR扩增产物的特异性和长度 化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则
设计引物的原则：


二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负 链序列互补 长度为18 ~ 25个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡 引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位 点、生物素等标记）
应用PCR技术分析一遗传性脊髓小脑性共 济失调（SCA)3型家系
NC:正常对照 PC:阳性对照 F:家系成员 M:Marker 结果： 家系成员1、3、 4有SCA3致病基 因突变; 家系成员2、5 未检测到突变
NC
1 2
3 4
5
F1
F2
F3
F4
F5
PC
M
2. 脊肌萎缩症

脊肌萎缩症( Spinal Muscular Atrophy , SMA)系指一类由于下运动神 经元变性导致的进行性骨骼肌无力和萎 缩的一组疾病 ,是儿童和少年常见的致 死性常染色体隐性遗传病之一 ,其隐性 致病基因携带率在人群中为 1/ 40～1/ 50 ,发病率为1/6000～1/10000.
Cห้องสมุดไป่ตู้ CA CA CA
CA
CA CA CA CA CA
Primer 2
CA CA
CA CA CA
CA
毛细管电泳分析PCR片段大小
分析
D4S1534 I-1 II-1 II-2 II-3 II-4 II-5 114,124 114,120 114,124 114,122 114,124 114,124

优点:
– 不包含内含子 – RT-PCR 能够检测异常的剪切体

缺点:
– 不易获得 – 要求操作特别小心且快速以免降解 –目的基因可能不在获得的材料组织中表达 –导致RNA不稳定的突变不能被检测
基因突变分析常用技术
分子杂交 聚合酶链式反应
Southern 印迹杂交
例如：脆X综合征
应用PCR相关技术进行基因突变 分析的策略与方法
策略与方法
直接分析法： PCR片段大小分析：片段大小有明显差异 PCR-RFLP：有酶切位点 PCR-测序：确定突变点碱基改变 多重连接探针扩增（MLPA）：片段缺失与重复 RT-PCR: 基因大，可取到新鲜材料，且基因在其中有表达
DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶复制的保真性：

Taq DNA聚合酶无3’ → 5’外切酶活性， 因而无校正功能，在复制新链的过程中 会发生碱基错配。 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移 码突变率为1/30000，碱基替换率为 1/8000。

扩增失败




试剂错加或漏加 实验中如发现对照样本也扩增失败，可用原试剂 重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。 试剂失效 变性温度偏低 有些 DNA 所含 G 、 C 碱基对丰富，当变性温度偏低 时，双链DNA不能完全解链。 退火温度偏高
MLPA 技术简介

MLPA
Multiplex ligation-dependent probe amplification 链接依赖型多探针扩增技术 最早由荷兰人Schouten JP (Schouten JP et al, 2002) 在原有PCR技术上发展出来
MLPA
技 术 原 理
MLPA方法检测DMD
间接分析法： PCR-STR连锁分析：基因大；在已知致病基因编码区未检测 到突变的家系
1. 脊髓小脑性共济失调


脊髓小脑性共济失调是遗传性共济失调的主要 类型，包括SCA1－27。成年期发病、常染色体 显性遗传及共济失调等是本病的共同特征，并 表现在连续数代中发病年龄提前和病情加重（ 遗传早现）。 SCA3是我国最常见的脊髓小脑性共济失调亚型 ，基因位于14q24..3－32，含4个外显子。CAG 突变位于4号外显子，患者扩增拷贝数为61－ 89，正常人为12－41。
直接基因突变分析： 适于散发病例和小家系病例。具有结 果判读的不确定性 连锁分析: 适于分析在已知致病基因编码区未检 测到突变的较大家系，不适于散发病例 和小家系病例

49
PCR-测序分析

在PKD1外显子编码序列上发现无义突变，使 突变碱基所在密码子由CGA变为终止密码子 TGA。
连 锁 分 析 结 果
应用PCR-RFLP技术分析脊肌萎缩症（SMA） 致病基因SMN
PCR扩增SMN基因 exon7,DraI酶切 PCR产物. 酶切N：正常人 PCR产物被酶切为 两条带 酶切P：阳性对照 PCR产物被酶切为 一条短带
病人1：结果显示 SMN基因有突变
病人2和3：结果 显示未有突变
3. 腓骨肌萎缩症(CMT)
T G G Val T C T Ser C A C Leu T G T Stop A A C C G
连锁分析
利用被定位的基因与在同一染色体
上另一遗传座位相连锁的特点，将该基
因定位在某一染色体或染色体某一区带
上。
常见遗传标记

DNA STR SNP
PCR-STR连锁分析
Primer 1
CA CA
3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循 环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以 指数形式增长。
3’ 5’
5’ 3’
d.NTPs
引物
耐热DNA聚合酶
添加反应混合液 及样本
加入试管中
变性
退火
3’
5’
5’
3’
延伸
3’
Taq Taq
5’
5’
3’
继续延伸
3’
Taq 5’ Taq
3’
循环
3’ 3’ 3’ 3’
前突变
CGG 55-200 全突变 CGG >200
Southern杂交法诊断Fragile X
F: Fully expanded and methylated NM: Methylated X do not cut with EclXI P: Unmethylated premutation N: X in normal male and active normal female
聚合酶链式反应（PCR）
Mullis F

"for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"