精确吸取芦丁标准液
0、"
1.
0、"
2.
0、"
3.
0、"
4.
0、"
5. 0 ml分别置于6支具塞试管中，各补70%乙醇至
5." 0ml，加5%亚硝酸钠溶液
0." 3 ml,，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝溶液
0." 3ml,摇匀，放置6 min后，再加4%氢氧化钠溶液
4." 0ml，加水
0." 4ml，摇匀，放置15 min后，在510 nm处测吸光度-浓度值，所得吸光度-浓度曲线见图，回归方程如下:
黄酮提取工艺设计思路
1、黄酮类化合物含量测定的原理
在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色。黄酮类化合物能与金属离子络合产生有色反应，于波长510nm附近有吸收，可用分光光度法进行测定。实验采用在碱性条件下，亚硝酸盐存在时，硝酸铝与黄酮形成红色络合物，在波长510nm附近有吸收可进行比色分析。
0."5%、30℃）、30min（2%、50℃）、60min（
0."5%、40℃）、60min（1%、30℃）。
（2）KMnO4法：
将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量KMnO4浸泡10min（KMnO4浓度1%、温度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（
0."5%、30℃）、30min（2%、50℃）、60min（
1
2、"黄酮类化合物的定性检测
1
2."
1、三氯化铝反应
取8支试管，分别加入少许经上述各提取方法所得的样品，用95%乙醇完全溶解，每只试管中再加1%三氯化铝乙醇溶液1～2 mL，观察颜色变化情况。在三氯化铝反应中，原来的黄色加深，并有黄色或黄绿色荧光，原因是与铝离子产生了螯合物而呈现出鲜黄色。滤纸上无明显颜色变化，紫外灯下显鲜黄色荧光，可能不含4’-羟基黄酮醇和7，4’-二羟基黄酮醇等黄酮类化合物。黄色或黄绿色：
6、线性范围、回归方程和检出限
总黄酮的线性范围在
1."0～40μg/ml之间，所得回归方程为y=
0."0033x－
0."0109，相关系数为
0."9995，检出限为
1."0μg/ml。
7、显色剂稳定性实验
精确量取标准溶液和样品提取液
1."0mL,同标准曲线和样品测定的操作，分别于配制后每隔5min测定其吸光度考察反应体系的稳定性。结果显示其RSD值为
0."2mg/mL芦丁对照品溶液
1."00mL、
2."00mL、
3."00mL、
4."00mL、
5."00mL样液，分别测定黄酮含量，根据所得的总黄酮含量减去加入的标量，再除以样品所含的总黄酮量即可计算出回收率。
回收率%=样品加标准样测得总黄酮含量−样品中总黄酮含量/加入标准液总芦丁的含量×100%
A=
12."721 0C-
0."02903，相关系数r=
0."9
998。"
4.
2、"样品处理
取采回的新鲜芦蒿叶，洗净，参考相关文献，在105℃烘至约八成干,剪成约1 cm长度，用粉碎机粉碎，再在105℃烘至恒重。采用Soxhlet提取法，以无水乙醚为脱脂剂,于43℃水浴中脱脂至充分除去样品中脂类和脂溶性色素。取出样品滤纸包，先置通风处晾干，再将滤纸包置烘箱中130℃烘干，放入干燥器中冷却备用。
4、样品溶液的测定方法
4.
1、"标准曲线的绘制
精确量取对照品溶液
0."
0、
1."
0、
2."
0、
3."
0、
4."
0、
5."
0、
6."0mL,分别置于25mL容量瓶中。
分别加水至6mL,加5%亚硝酸钠溶液
1."0mL,混匀,放置6min;加10%硝酸铝溶液
1."0mL,摇匀,放置6min;加1%氢氧化钠溶液
4.
3、"样品处理方法
湿热法：
将鲜叶置于高压反应釜加压蒸30min，另取鲜叶常压蒸30min。将阴干叶置于高压反应釜加压蒸15min，另取阴干叶常压蒸15min。
氧化法：
（1）H2O2法：
将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量H2O2浸泡10min（H2O2浓度1%、温度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（
取样品液5mL，加入少许镁粉振摇，滴加数滴浓盐酸，微热2min。并作空白对照实验（在样品液中仅加入浓盐酸进行观察）。可观察到在用粗提取液进行预试时，加入浓盐酸后升起的泡沫颜色呈紫红色，溶液显橙红色，表明样品液中有黄酮类物质存在。橙红色：
黄酮类化合物。
取自制的黄酮样品少许置于试管中，加5%vol的乙醇2mL，在水浴中加热溶解，滴加2滴浓HC1，再加镁粉约50mg，即产生剧烈的反应。反应过程中溶液颜色逐渐由黄色变为橙红色。此现象表明被测物为黄酮类物质。
0."162%,测定结果的相对标准偏差很小,说明仪器的精密度较高,实验数据可靠。
在正交试验得出的最佳条件下，样品用超声波提取后测定总黄酮提取量，重复试验5次，计算保健食品总黄酮提取量为（
5."370±
0."092）mg，RSD为
1."717%，证明该方法的精密度较好。
按微波提取法同时制备5份试样液，按标准曲线方法对试样液中总黄酮含量进行平行测定。
0."2mg。或精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10mg,置50mL容量瓶中,加无水乙醇20mL,轻摇使充分溶解,定容,摇匀,得
0."2mg /mL芦丁标准液。
精确称取芦丁标准品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含芦丁对照品
0."1mg芦丁标准品溶液。
称取约20mg芦丁标准品于称量瓶中置105℃烘箱下烘干至恒重,干燥器中冷却，精确称取10 mg芦丁标准品，用70%乙醇定容至100 ml为标准液。
配合物在Kmax
1= 354nm及Kmax
2= 510nm有两个吸收峰,经实验后得出Kmax
1=354nm波长处得到的工作曲线线性关系及精密度数据均不佳,故本实验选取Kmax
2= 510nm为测定波长。
3、标准溶液的配制
精确称取105℃干燥恒重芦丁对照品50mg,加乙醇适量,使之充分溶解,用乙mL,置于50mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。每1mL溶液含芦丁对照品
有黄酮类化合物。
1
2."
2、盐酸-镁粉还原反应
将经上述各提取方法所得的样品分别溶于盛有95%乙醇的试管中，待完全溶解后加少许镁粉，再加数滴浓盐酸,观察颜色变化情况。在盐酸-镁粉还原反应中,溶液呈现出橙黄色或紫红色,这是由于黄酮类化合物被还原生成花色苷元及其二聚物。试液呈现红色，可能含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物。
2、测定波长的确定
取样品溶液和标准溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL,然后加入5 %的NaNO2溶液1 mL,室温放置6min,再加入10 %的Al(NO3)3 1mL,混匀,室温放置6 min,加入4%的NaOH10mL,用水稀释至25 mL,混匀,放置15 min,在分光光度计上扫描波长从400 nm～600 nm之间的吸收度,结果在510nm波长处有最大吸收值。
4."6 mm；柱温为室温；流速1 mL/min；检测器：
SPD-10A；检测波长254 nm；进样量20 μL；流动相：80%甲醇。在进柱之前，流动相要经过
0."45μm的有机膜过滤，并超声脱气30 min。
5、溶剂选择
分别称取样品1g，以提取温度90℃，提取时间2 h，分别利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚为溶剂，料液比1:50(g/mL)为提取条件进行常压回流提取，以此结果进行比较。
在中性或弱碱性及硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成鳌合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，硝酸钠还原黄酮，加硝酸铝络合，加氢氧化钠使黄酮类化合物开环，生成2’-OH查耳酮而显色。
利用黄酮类化合物中的3－羟基、4－羟基、5－羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与Al3＋进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物的原理测定其含量
0." 5097% ,说明样品溶液在1h内稳定。
8、加标回收率实验
取已测得黄酮类化合物提取率的样品溶液
2."0mL,加入
0."2mg/mL的芦丁对照液
1." 0mL,按实验方法测定,计算回收率。加样回收率为
99." 12%, RSD值为
2." 135%。表明,该方法对黄花菜中黄酮类化合物提取率测量的准确度较高。回收率= (混合后测得的总黄酮含量-样品中总黄酮含量)/芦丁标准品加入量×100%。
分别取
0."2g含总黄酮的样品于两支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入
0."100mg芦丁标准品作为加标测定管，另1管作为本底管，再按最佳试验条件进行样品处理，用标准曲线法进行计算，重复试验3次，计算回收率。由表8可知，该方法的回收率为95%~104%，证明该方法的准确度较好。
取5个10mL比色管，在已知黄酮含量的蓖麻叶和蓖麻花提取液中分别加入
1
2."
3、四氢硼钠反应
取8支试管，分别加入少许经上述各种方法提取所得到的样品，用95%乙醇完全溶解后加数滴四氢硼钠，观察颜色变化情况。在四氢硼钠反应中，溶液由浅黄色变为红色或紫红色，此反应是二氢黄酮类化合物的专属反应。
12."