姓名：刘金鑫学号：201428006037073 培养单位：地理所
生态毒理学实验设计
一.【实验题目】：
砷对两种淡水藻类的毒性作用。
二.【实验设计思想】：
砷在环境中是一种普遍存在的污染物，它来源于人为源和自然源的释放，通过一定的途径进入地表、土壤和饮用水体中。
通过目前的研究已经发现进入水体的砷对水中的生物存在影响，我们有必要研究水体中砷对水生生物的毒性作用，在这些研究中要数藻类的研究较多。
我准备通过使用72小时生长速率——一种抑制生物检测方法，来判定五价砷和三价砷对两种在无外来干扰的热带的淡水藻类（绿藻和单针藻）的毒性。
这个实验的意义在于，看砷对藻类的毒害作用是否很强，如果藻类对于砷的耐性较强，可以指导后面的藻类用于砷污染水体修复的研究。
三.【实验目的】：
1、掌握藻类的室内无菌培养。
2、学会藻类生长速率测定的方法。
3、掌握72小时生长速率的检测方法。
4、判定砷对两种藻类的毒害作用。
四.【实验原理】：
1、藻类的选取：由于不同种类的藻对砷毒性的反应不同，有的藻对砷比较敏感，而有的对砷的耐性较好，所以我选择了一种敏感性的单
针藻和一种耐性较好的绿藻。
2、培养液的选择：为了排除自然水体和纯净水体的影响，我用人工合成的软水（内部成分以及含量都是已知的）来进行实验。
3、培养瓶的选择：为了防止砷在普通瓶体上的吸附，我选择250ml 的硼硅酸盐的锥形瓶。
4、检测前处理：将处于指数生长阶段（5-6天）的细胞通过离心（2500rpm，7min），超纯水洗涤三次确保培养液除去后，再用于生物检测。
5、培养条件：将培养瓶放在培养架上进行培养。
培养架周围的环境条件：27±1℃、12：12h的光照和无光、每天用手摇晃两次锥形瓶使其进行充分的气体交换。
6、通过多功能计数仪测定结果。
7、数据分析：通过线性插值法计算72hIC50。
8、藻对砷和磷的吸收具有竞争性。
五.【实验材料】：
绿藻、单针藻、玻璃烧杯、天平、硼硅酸盐锥形瓶、镊子、酒精灯、量筒、真空过滤器、滤膜、试管、无菌操作台、吸管、多功能计数器、移液枪、PH试纸（PH5.4—9）、牛角匙、牛皮纸、棉花、纱绳、高压蒸汽灭菌锅、培养架、温度计、恒温室、冷光源、NaHCO3、CaSO4·2H2O、MgSO4、KCl、CaCO3、10%HNO3、超纯水、Na2AsO4·7H2O、NaAsO2、NaNO3、KH2PO4等。
六.【实验步骤】：
1、软水的配制：向1L纯净水中加入96mg NaHCO3、60mg CaSO4·2H2O、123mg MgSO4、4mg KCl、134mg CaCO3最后把pH调到7.6±0.1，再重复上面的过程7次，一共配制8L的软水。
2、软水的过滤（灭菌）：配制的软水通过被醋酸或硝酸酸洗的0.45μm的纤维膜真空过滤并保存在4℃恒温箱中。
3、软水分装并编号（无菌台操作）：在72个锥形瓶中分别加入70ml 的软水，并将其按不同藻和加入的不同砷以及不同的营养比标号（a-b-c第一位表示什么藻加的什么价态砷；第二位表示砷的不同浓度；第三位表示不同的营养比）如：1-1-1表示单针藻、五价砷-第一浓度-第一样品；1-1-2表示单针藻、五价砷-第一浓度-第二样品；1-2-1表示单针藻、五价砷-第二浓度-第一样品；2-1-1表示绿藻、五价砷-第一浓度-第一样品；3-1-1表示单针藻、三价砷-第一浓度-第一样品；4-1-1表示绿藻、三价砷-第一浓度-第一样品；每种测试包括五个砷浓度和一个空白组，每个浓度下有三个营养比。
4、添加砷的浓度范围：对于绿藻，三价砷处理的范围是10-200mg/L,五价砷处理的范围是0.75-60mg/L；对于单针藻，三价砷的处理范围时5-50mg/L，五价砷出路范围是0.025-0.400mg/L。
5、在无菌台进行添加砷（添加前需要过滤灭菌）的操作：对于第一位为4的（绿藻三价砷）添加至浓度分别为：0、10、60、110、160、200mg/L；对于第一位是2的（绿藻五价砷）添加至浓度分别为：0、0.75、15.75、30.75、、45.75、60mg/L；对于第一位为3的（单针藻三价砷）添加至浓度分别为：0、5、1
6、2
7、3
8、50mg/L；对于第一
位是1的（单针藻五价砷）添加至浓度分别为：0、0.025、0.119、0.213、0.307、0.400mg/L。
6、添加营养素（添加的营养素需要通过过滤灭菌）：添加营养素的三种类型：①、15mg/L NO3-和0.15mg/L PO43-（摩尔比 N：P=150:1）；
②、15 mg /L NO3-和 1.5 mg / L PO43-（摩尔比 N:P=15:1）；③、1.5 mg /L NO3-和 0.15 mg /L PO43-（摩尔比N:P=15:1）。
在所有锥形瓶中加入①，再在第一位为1第三位为2中都加入②，在第一位为1第三位为3中都加入③。
（此过程在无菌台操作）
7、接种培养：添加完后在无菌台进行接种，再放入培养室中培养（温度：27±1℃，12：12h光照）
8、测定：每天测定pH，如果发生较大的变化就用盐酸或者氢氧化钠调节；每天都用多功能计数仪测定生长速率（测量5-7天）。
每天用手晃动两次使其瓶内发生气体交换。
七.【实验结果】：。