SSR分子标记遗传分析
实验原理：
SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。
由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记。
虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。
优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；
（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；
（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。
缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高
实验材料：
欧美山杨杂种幼嫩叶片
实验器具、药品：
模板DNA、dNTP、PCR提取Buffer、Mg2+、上游引物、下游引物、Taq酶、去离子水、琼脂糖、Gel-RED染色剂、1×TAE、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外凝胶成像系统
SSR引物及退火温度
位点Loci
重复单元
Repeat unit
引物序列(5′-3′)
Primer sequence (5′-3′)
退火温度
T(℃)
PTR2 (TGG)8AAGAAGAACTCGAAGA TGAAGAACT(F) ACTGACAAAACCCCTAA TCTAACAA(R)
63℃
PTR7 (CT)5A T(CT)6A TTTGA TGCCTCTTCCTTCCAGT(F)
TA TTTTCA TTTTCCCTTTGCTTT(R)
49.4℃
PTR14 (TGG)5TCCGTTTTTGCA TCTCAAGAA TCAC(F)
A TACTCGCTTTA TAACACCA TTGTC(R)
55.4℃
实验步骤：
1.总DNA的提取
采用CTAB法提取植物总DNA
（1）取700ul CTAB提取液加入20ul巯基乙醇于65℃金属浴内预热；
（2）称取适量植物叶片,放入消过毒的研钵中,迅速加入液氮研磨成白色粉末；
（3）将粉末移入提取液,混匀,65℃水浴（或金属浴）30min,其间不时的温和摇匀；
（4）加入700ul氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇匀,10000rpm 离心10min,取上清(重复2次)；（5）加入700ul异丙醇室温沉淀10min,10000rpm 离心10min,弃上清；
（6）用70%乙醇洗两次,37℃气干.去除DNA表面的盐或试剂小分子物质；
（7）加入20ul灭菌的去离子水溶解DNA；
（8）利用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA的含量和纯度。
2.总DNA的检测
用琼脂糖凝胶电泳法对所提取到的基因组DNA进行质量检测。
通常用浓度为0.7%(W/V)的琼脂糖凝胶电泳检测植物的基因组DNA,步骤如下:
（1）称取0.14g琼脂糖,加入20ml 1×TAE电泳缓冲液，在微波炉中加热2分钟左右将琼脂糖溶解（以上数据根据制胶板大小及胶厚度而变化）；
（2）将琼脂糖倒入模具,凝胶厚度一般为0.3-0.5cm迅速在模具一端安插好梳子,检查有无气泡,如有气泡,将气泡赶走。
（3）室温下避光水平放置15-20分钟后,琼脂糖溶液完全凝固,小心拔出梳子,将凝胶放置于电泳槽中。
（6）加入电泳缓冲液至电泳槽中,让液面高于胶面1mm,这样凝胶两端的电压几乎与外加电压相等,电泳效率高。
注意：电泳槽中的缓冲液与凝胶配制所用的缓冲液应为同一批配制，若电泳缓冲液与凝胶中的离子强度和PH值不一致将影响核酸的迁移。
（7）在3ul DNA样品中加入1-2ul的上样缓冲液充分混匀，用移液器将DNA样品加入样品孔中。
溴酚蓝，分子量为670，在不同浓度的凝胶中迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳故被普遍用作指示剂。
（8）接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，切记DNA样品向正极泳动。
电压选择为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算),经过计算,选择40V电压
（9）根据指示剂的位置，判断是否终止电泳，切断电源后，再取出凝胶。
含染色剂的凝胶可以直接紫外灯下观察结果或拍照记录。
3.PCR扩增
反应总体积20μL包括:引物F 2μL；引物R 2μL；DNA模板2μL；Taq酶0.3μL；dNTP
O 8.9μL。
1.6μL、10×buffer 2μL；Mg2+ 1.2μL；H
2
反应程序: 94℃预变性3min； 94℃变性45s；退火温度52℃ 45s；72℃延伸105s，反应30个循环；72℃延伸10min。
4.PCR产物的电泳分离
用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离PCR产物。
（1）胶板的制备：
①把电泳用的玻璃板分别用水洗净，并用去离子水冲一遍，晾干；
②配胶（21ml）；10.08g尿素，2.1ml 10xTBE，4.2ml 30%的丙烯酰胺加水至21ml
（2）灌胶：在配好的凝胶中加入10.5ul 的TEMED，再加入105ul AP 轻轻摇匀，注意不要起气泡。
然后立起胶板，稍微倾斜，将配好的胶沿玻璃的一侧缓慢倒入胶板间的空隙内，倒满胶后，垂直放置胶板，将梳子的平面插入胶面，静置3h 以上，或过夜。
（胶中不要留有气泡）
（3）上样：胶凝后，轻轻拔出梳子，把胶板固定在电泳槽上，在槽中加入1xTBE溶液没过胶面。
在20ul 样品中加入5ul 凝胶加样缓冲液于80-100℃加热变性5min后立即放于冰上，使其保持单链状态。
上样用微量进样器，混匀，每个样品取10ul。
4.电泳：上完样后，立即开始。
当第二道染料（二甲苯箐FF）即将出胶时停止电泳（一般3h）。
5.银染
（1）倒出电泳液，取下胶板，将两块板轻轻撬开。
用拨胶器将胶从胶板上取下来，放入固
定液中。
（2）固定：将胶放入方盘中，倒入固定液，没过胶面。
轻轻晃动15min，将胶板取出，回收固定液；用去离子水浸泡2min，控干，重复两次。
（2）染色；将胶转入染色液，轻轻摇15min；取出后用去离子水浸泡2min，控干；在去离子水中浸泡20s，立即取出，控干水。
（4）显影：将胶放置于300ml 预冷的显影液中，充分摇动，直至其余条带清晰可见；将回收的等体积固定液倒入显色液中，摇3-5min终止显色；用去离子水洗两遍。
（5）将胶用凝胶成像系统白光照相保存或将胶板置于室温晾干。
然后扫描。