课程教学日历课程名称：微生物学(实验部分) 授课学期：2010～2011学年度第一学期实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1.学习和掌握培养基配制的一般方法与步骤2.掌握高压蒸汽灭菌的原理及操作方法3.学会制作棉塞二、实验原理1.培养基配制的一般原则2.高压蒸汽灭菌原理强调温度而非压力三、实验材料及用具药品：牛肉膏，蛋白胨，琼脂，氯化钠，可溶性淀粉，葡萄糖，马铃薯，硝酸钾，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸铁用具：试管，三角瓶，铁架台，烧杯，量杯，玻璃棒，锅，天平，药匙，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布，线绳，高压灭菌锅四、实验方法与步骤称量→溶解→定容→调PH→分装→加塞→包扎→灭菌→摆斜面→无菌检查注意强调1.琼脂等药品添加注意事项（牛肉膏，高氏一号，PDA）2.分装时的注意事项并示范3.灭菌加水→装料→加盖→排气→升压→保压→降压→无菌检查五、实验演示1.培养基分装方法2.棉塞的制作3.试管斜面的搁置六、作业与思考实验报告分组：牛肉膏蛋白胨培养基 1500ml 40斜面余三角瓶高氏一号培养基 1500ml 30斜面余三角瓶PDA培养基 2000ml 60斜面余三角瓶淀粉水解培养基 1000ml 8斜面余三角瓶同时灭无菌水待用“多多益善”实验二油镜的使用及常见细菌形态观察一、实验目的1．掌握细菌基本形态和特殊结构的观察方法。

2．掌握光学显微镜油镜的使用和维护方法，了解荧光显微镜和暗视野显微镜的构造和使用方法。

二、实验原理1．油镜的使用原理图1-2 显微镜油镜的使用原理油镜的放大倍数高而透镜很小，自标本片透过的光线，因玻片和空气的折光率不同（玻璃n=1.52，空气n=1.0），部分光线经载玻片进入空气后发生折射，不能进入接物镜，致使射入光线较少，物象不清晰。

在油镜和载玻片之间滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，物象清晰（见图1-2）。

三、实验材料及用具1．示教片：各种球菌、杆菌、弧菌、荚膜、鞭毛、芽胞的示教片。

2．器材及其他：光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂等。

四、实验方法与步骤（一）、细菌基本形态和特殊构造的观察1．细菌的基本形态（各种球菌、杆菌、弧菌等）观察要点：注意细菌的染色性、相对大小、形状及排列方式。

2．特殊结构的观察（荚膜、芽胞、鞭毛）观察要点：注意这些特殊结构的大小、形状及其在菌体中的位置，均有助于细菌的鉴定。

（二）、光学显微镜油镜的使用1．光学显微镜的构造光学显微镜是观察细菌形态最常用的一种仪器，其构造分为机械部分和光学部分，机械部分包括：镜座、镜臂、载物台、镜筒、镜头转换器、调焦装置等；光学部分包括：接物镜、接目镜、反光镜、聚光器、光圈等（见图1-1）。

图1-1 光学显微镜的构造显微镜的接物镜有低倍镜、高倍镜、油镜三种，放大倍数依次增高，其识别方法为：（1）低倍镜：镜头标志为10×或10/0.25，镜头最短，其上常刻有黄色环圈。

（2）高倍镜：镜头标志为40×或40/0.65，镜头较长，其上常刻有蓝色环圈。

（3）油镜：镜头标志为100×或 100/1.30，镜头最长，其上常刻有白色环圈，或“oil”字样。

2．使用方法（1）采光：使用显微镜时必须端坐，将显微镜放在胸前适当位置。

将低倍镜转到中央并对准下面的聚光器，打开光圈，转动反光镜，使光线集中于聚光器（以灯光为光源时，使用凹面反光镜，以自然光为光源时用平面反光镜）。

根据所观察的标本，通过升降聚光器和缩放光圈以获得最佳光度。

当用低倍镜或高倍镜观察时，应适当缩小光圈，下降聚光器；当用油镜观察时，光线宜强，应把光圈完全打开，并将聚光器上升到最高位置。

（2）低倍镜调焦：将欲观察的标本置载物台上，用弹簧夹和推进器固定，将待检部位移至视野正中央，上升载物台至不能升高为止。

用左眼观察接目镜，缓慢调节粗调节器，使载物台下降，待看到模糊的图像时，再调节细调节器，直至看到清晰的图像为止。

（3）油镜的使用：低倍镜找到物象并调至清晰之后，转开物镜头，在玻片的标本上滴加1滴香柏油，将油镜头转换至中央，缓慢调节粗调节器，使镜头浸入油中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动（从侧面观察），边观察接目镜边轻轻转动粗调节器（此时只能上升镜头，不能下降，防止压坏玻片及损坏物镜），待看到模糊物象时改调细调节器，直至找到清晰物象。

镜检时应将标本按一定方向呈“弓”形移动，直至整个标本观察完毕，以防漏检。

观察时应将两只眼睛同时睁开，左眼观察，右眼用于绘图或记录。

标本观察完毕后，先将物镜头移开，再转动粗调节器使载物台下降，取下载玻片，立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。

4．注意事项（1）显微镜是精密光学仪器，在搬放时应右手紧握镜臂，左手稳托镜座，平端在胸前，轻拿轻放。

（2）显微镜放到实验台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节器的装置易损坏。

（3）避免强酸、强碱、氯仿、乙醚、酒精等化学药品与显微镜接触，避免日光直射，显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。

（4）接目镜和接物镜不要随便卸下，必须抽取接目镜时，须将镜筒上口用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。

更换接物镜时，卸下后应倒置在清洁的台面上，并随即装入木箱的置放接物镜的管内。

（5）细调节器是显微镜最精细而脆弱的部分，不要向一个方向连续转动数周，应轻微地来回旋转。

（6）镜头必须保持清洁，油镜使用完后应立即用擦镜纸拭去香柏油。

若油镜镜头上的油迹未擦干净，应先将1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头，再用干净擦镜纸将镜头上残留的醇醚混合液或二甲苯擦净。

（7）显微镜擦净后，取下标本片，下降聚光器，再将物镜转成“品”字形，送至显微镜室放入镜箱内。

五、作业与思考1.实验报告实验三细菌运动性观察及革兰氏染色一、实验目的1.学会制作水浸片观察细菌运动性（压滴法）2.掌握革兰氏染色步骤3.初步掌握无菌操作技术二、实验原理1.革兰氏染色的原理三、实验材料及用具E.coli，金黄色葡萄球菌（培养8-24小时）各6支，载玻片，盖玻片，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，无菌水，接种环，酒精灯，火柴，吸水纸，革兰氏染色液四、实验方法与步骤1.细菌运动性观察制水浸片→低倍镜→高倍镜→油镜→清理→还原强调各步注意事项清理步骤2.革兰氏染色a.制片涤菌（混合）→干燥→固定（过火）b.染色结晶紫初染1分钟→水洗→碘液媒染1分钟→水洗→ 95%酒精脱色30 秒-1分钟→水洗→沙红复染1分钟→水洗→干燥→镜检强调各步注意事项制片水滴要小，过火不等于烧，染色是混合片，菌量适当，时间合适。

关键步骤是脱色五、实验演示无菌操作技术六、作业与思考1.实验报告2.绘E.coli，金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果图实验四酵母菌、霉菌个体及菌落特征观察一、实验目的1.学习酵母菌，霉菌形态观察方法2.了解并掌握酵母菌，根霉，曲霉，青霉的形态特征二、实验原理（略）三、实验材料及用具酵母菌（培养48小时），根霉，曲霉，青霉（培养3-5天）各6皿，载玻片，盖玻片，显微镜，无菌水，接种环，酒精灯，火柴，透明胶带四、实验方法与步骤1.菌落特征观察2.个体形态观察酵母菌挑取法水浸片霉菌透明胶带粘贴法酵母菌：形态，假菌丝，厚垣孢子，出芽情况根霉：菌丝无隔，葡萄菌丝，假根，包囊梗，孢子囊，包囊孢子曲霉：菌丝有隔，足细胞，顶囊，分生孢子梗掌状分支，串生分生孢子青霉：菌丝有隔，无足细胞，无顶囊，分生孢子梗扫帚状分生孢子串生单轮生，双轮生，多轮生对称，不对称五、作业与思考1.实验报告2.绘酵母菌，根霉，曲霉，青霉个体形态图实验五土壤微生物的分离与纯化一、实验目的1.学习和掌握从土壤中分离纯化微生物的方法涂布平板法，倒平板法，划线法2.巩固无菌操作技术3.学会制平板，包培养皿二、实验原理不同微生物要求营养条件不同，选用不同培养基对土壤中细菌，放线菌，霉菌进行分离，并通过加入一些物质制成选择培养基而达到分离的目的三、实验材料及用具土壤，灭菌的三角瓶，移液管，试管，培养皿，酒精灯，火柴，无菌水，涂布器，培养箱，接种环，培养基，链霉素，10%酚，斜面，电热炉四、实验方法与步骤1.土壤的制备称土样10g→90ml无菌水中→于三角瓶中振荡20分钟，分别稀释10-2 10-3，10-4，10-5几个浓度于试管中，加9ml无菌水2.制平板溶培养基→冷却45℃左右→倒平板 PDA+链霉素高氏一号+10%酚3.涂布平板分离取0.2ml土悬液→平板→涂布→培养细菌30℃1-2天，放线菌，霉菌25℃5-7天4.纯化平板划线法纯化细菌，放线菌制平板→划线→培养点接法纯化霉菌制平板→点接→培养5.转管五、实验演示1.无菌操作制平板2.培养皿的包法六、作业与思考实验报告实验六霉菌孢子数量的测定一、实验目的1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二．实验原理血球计数板的构造原理：血球计数板是一块特制的厚的载玻片，其上由四条竖槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短的横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格为计数室。

计数室的刻度有两种规格即16×25或25×16的。

现在常用25×16的，即计数室（一个大方格）分成25个中方格，每个中方格由分为16个小方格。

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）三、实验材料及用具1．菌种霉菌2．仪器或其他用具血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。

四、实验步骤l．菌悬液制备以无菌生理盐水将霉菌孢子制成浓度适当的菌悬液。

2．镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3．加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。

4．显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。