5．实验过程中,切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇 火险,应先关掉火源,再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。
6．使用显微镜或其他贵重仪器时,要求细心操作,特别爱护。对消耗材 料和药品等要力求节约,用毕后仍放回原处。
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7．每次实验完毕后,必须把所用仪器抹净放妥,将实验室收拾整齐,擦 净桌面,如有菌液污染桌面或其他地方时,可用 3%来苏尔液或 5%石炭 酸液覆盖其上半小时后擦去,如系芽孢杆菌,应适当延长消毒时间。凡 带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前须浸泡在 3%来苏尔液中进 行消毒。 8．每次实验需进行培养的材料,应标明自己的组别及处理方法,放于教 师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等,未经教师许可,不 得携出室外。 9．每次实验的结果,应以实事求是的科学态度填入报告表格中,力求简 明准确,并连同思考题及时汇交教师批阅。 10．离实验室前应将手洗净,注意关闭门窗、灯、火、煤气等。
霉菌菌丝一般可从培养体上直接调取，作成水浸片。具体方法：在清洁载玻片中 央，加蒸馏水一滴，用解针挑取少量菌丝放入水滴中，这时两手各持针一支，将菌丝 分开，不使缠结成团。挑开菌丝后，轻轻加上盖玻片，注意不要产生气泡，先用低倍 镜后用高倍镜观察。 三、作业 1．绘图、记录南昌链霉菌、青霉、木霉、曲霉和根霉的形态。 2．绘图、记录梨头霉的接合孢子形态。 3．用水浸片法观察丝状真菌应注意哪些事项？
1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习,以了解实验的目的、原 理和方法,做到心中有数,思路清楚。
2．认真及时做好实验记录,对于当时不能得到结果而需要连续观察的 实验,则需记下每次观察的现象和结果,以便分析。
3．实验室内应保持整洁,勿高声谈话和随便走动,保持室内安静。
4．实验时小心仔细,全部操作应严格按操作规程进行,万一遇有盛菌试 管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时,应立即 报告指导教师,及时处理,切勿隐瞒。
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实验四 微生物的大小测定与数量的测定
一、实验目的 1．学习了解测微尺的结构，掌握测定微生物大小的方法。 2．观察酵母菌的形态，掌握鉴别死活酵母菌的方法。 3．学习了解血球计数板的结构，掌握微生物数量测定的方法。 二、实验内容 1．在低倍镜和高倍镜下求出目镜测微尺的校正值。 （1） 目镜测微尺和镜台测微尺
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实验三 污水环境细菌运动性与原生动物、藻类的形态观察
一、实验目的 1．学习掌握用悬滴法观察细菌运动性的方法和技术。 2．学习掌握用水浸片法观察原生动物和藻类的形态。 二、实验内容 1．用悬滴法观察污水中细菌的运动性，注意运动方向。 2．用水浸片法观察原生动物的形态、运动性并注意分类。 （1） 鞭毛虫类（Flagellata）：绿眼虫、波豆虫 （2） 肉足虫类（Sarcoclina）：变形虫、太阳虫 （3） 纤毛虫（Ciliata）：草虫、肾形虫、钟虫、豆形虫、漫游虫等 3．用水浸片法观察藻类的形态、种类并注意分类。 （1） 绿藻：空球藻属（Fudoria）
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片的中央刻有一小尺，它是在 5 毫米内作 50 等分刻制的，每一等份为 0.1 毫米。另一规格是 5 毫米作 100 等分，每等分为 0.05 毫米。
镜台测微尺是刻在载玻片中央的小尺，它是在 1 毫米内作 100 等分刻成的，每等 分 10 微米。 （2） 目镜测微尺校正的方法
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实验二 放线菌与霉菌形态观察
一、实验目的 1．学习掌握插片法和水浸片法观察放线菌和霉菌的方法。 2．学习掌握低倍镜和高倍镜观察丝状菌体的技能。 二、实验内容 1．用插片法观察绘图放线菌的形态并注意“三丝”分化。
将灭菌的盖玻片斜插在涂布放线菌孢子的培养基的平板上，一半露在外面，恒温 培养后在培养基表面和盖玻片上部都有放线菌生长，小心取出盖玻片，放在干净的载 玻片上，在显微镜下直接观察。 2．用水浸片法观察：青霉（Penicillium.sp）、曲霉（Aspergillus.sp）的形态和分生孢 子。 根霉（Rhigopus.sp）的假根和孢囊孢子。 梨头霉（Absidia.sp）的接合孢子， 木霉（Trichederma.sp）的形态，注意分枝形态。
盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约 的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨 率为准。
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1． 数值孔径 数值孔径（又称开口率 numerical aperture 简写 NA）是物镜和聚光镜的主要技术
参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标 刻在物镜和聚光镜的外壳上。 数值孔径是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的 正弦，乘上标本与物镜间介质的折射率的乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2 成正 比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大 NA 值，孔径角是无法增大的， 唯一的办法是增大介质的折射率 n 值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜， 因介质的折射率 n 值大于 1，NA 值就能大于 1。
环境微生物学实验指导书
王 华 主编
江西农业大学 国土资源与环境学院
2007 年 10 月
目录
微生物实验须知……………………………………………………………3 实验一 显微镜使用与细菌染色法………………………………………5 实验二 放线菌与霉菌形态观察…………………………………………10 实验三 污水环境细菌运动性与原生动物、藻类的形态观察…………11 实验四 微生物的大小测定与数量的测定………………………………12 实验五 培养基的制备与灭菌……………………………………………16 实验六 环境微生物的分离与生理鉴定实验……………………………18 实验七 环境微生物分离与生理鉴定结果检查…………………………22 实验八 水中总大肠菌群的测定－多管发酵法…………………………24
低倍、高倍和油镜接物镜的识别方法，可直接读它上面刻的倍数，简便方法是低 倍镜较短，高倍镜较长，油镜更长且上面刻有黑圈。使用时一定要识别清楚，不可认 错，否则在转换物镜时会碰压镜头，损坏物镜的危险。放大倍数越高的接物镜它的焦 距越小，工作距离也越小，因此油镜观察时镜头和玻片极为接近，使用时应该注意。
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分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不 够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放 大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之 如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太 小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径 与显微镜总放大倍率合理匹配。 4．镜头的识别
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3． 放大率和有效放大率 由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目
镜放大率的乘积。显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过 调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜 的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大 倍率。
三、实验方法 1．用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作简单染色：
涂片→干燥→固定→染色→镜检 （1）涂片：在玻片中央滴一滴蒸馏水，然后取菌少许，洗入蒸馏水滴中，做成薄 薄一层。 （2）干燥：细菌涂片一般应让他自然风干。有时为使它干得快些，可以把涂片小 心在酒精灯火焰上微微加热烘干。 （3）固定：细菌涂片常用火焰固定法。即将涂片不快不慢地在火焰上通过 2-3 次，菌体受热固着于玻片上。 （4）染色：细菌简单染色常用石炭酸复红或草酸铵结晶紫为染色剂。在已固定的 涂片上加一大滴石炭酸复红染色液，使盖住整个涂抹面，静置染色 1 分钟。 （5）水洗：染色完毕用自来水把玻片上的染色液冲洗干净。 （6）镜检：将染色片晾干，或用吸水纸把多余的水吸去晾干，再用显微镜观察。 2．用大肠杆菌(E.coli)和金色葡萄球菌(staphylococcua aureus)作革兰氏染色: 染色方法的要点及原理：先用结晶紫染色，再加碘液固定，酒精处理后用番红复 染。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 染色的具体步骤：涂片→固定→初染→媒染→脱色→复染→镜检 （1）取菌按常法涂片、干燥、固定。 （2）草酸铵结晶紫染色 1 分钟。 （3）充分水洗后加碘液处理 1 分钟。 （4）水洗后酒精脱色 15-20 秒。（用酒精连续滴洗，至不溶出颜色为止）。 （5）水洗后加番红染色 1 分钟。 （6）充分水洗，吸去余水后晾干，镜检。 四、作业 1．画出你在油镜下观察到的细菌形态并注明放大倍数？ 2．在染色中，固定一步起何作用？酒精脱色一步为何是关键？ 3．用油镜观察应注意哪些问题？滴加香柏油起什么作用？ 4．油镜使用完后应如何处理？
珊藻属（Scendesmus） 鼓藻属（Cosmarium） 小球藻属（Chlorella） 盘星藻属（Pediastrum） （2） 裸藻：眼虫藻属（Euglena） （3） 硅藻：舟形藻属（Navicula） 直链藻属（Melosira） 平板藻属（Tabellaria） 三、作业 1．绘图记录细菌的运动方向，悬滴法观察应注意哪些事项？ 2．绘图记录原生动物、藻类的形态、种类和名称。
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微生物实验须知
微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作 技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学 理论。同时,通过实验,培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的 能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良 好作风。为了上好微生物学实验课,并保证安全,特提出如下注意事项：
2． 分辨率 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，。其计算公式
是 σ = λ/NA 式中 σ 为最小分辨距离；λ 为光线的波长；NA 为物镜的数值孔径。可见 物镜的分辨率是由物镜的 NA 值与照明光源的波长两个因素决定。NA 值越大，照明 光线波长越短，则 σ 值越小，分辨率就越高。 要提高分辨率，即减小 σ 值，可采取以下措施 （1）降低波长 λ 值，使用短波长光源。（2）增大介质 n 值以提高 NA 值（NA=nsinu/2）。 （3） 增大孔径角 u 值以提高 NA 值。（4） 增加明暗反差。