实验名称：叶绿体色素的提取分离及其理化性质
【中文摘要】
本实验在提取叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，分别进行色素的分离和植物叶绿素理化性质的观察与检验。
【英文摘要】
In this study, the extraction of chloroplast pigments (chlorophyll and carotenoids), the pigments were separated and the physical and chemical properties of chlorophyll observation and testing.
【实验原理】
提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。
对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。
理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。
叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。
【实验目的】
以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质.
【实验器材和试剂】
1、材料：菠菜
2、用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试管等
3、试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜
【实验步骤】
1.叶绿体色素的提取
1).取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;
2).加入少许石英砂和CaCO
,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml;
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3).用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处).
2.纸层析分离叶绿体色素
1）.层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约1cm×0.5cm 的窄条;
2）.点样,用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部,用吹风机吹干后在原处重复点样7-8次;
3）.展层,在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样的层析纸插入缸的側壁槽内,调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中,盖好盖子,于阴暗处展层约10min,即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层;
3.叶绿体理化性质的观察
1）.荧光现象的观察
取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色.
2).皂化作用
在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中加入2ml的20%KOH-甲醇溶液,充分混匀.吹打5分钟;沿试管壁缓慢加入3ml乙醚+4ml的蒸馏水,边滴加边摇动,直至看到溶液逐渐分为两层为止. 对照不加KOH-甲醇溶液.
3).叶绿素分子中Mg2+的取代作用
取2只试管,分别加入2ml叶绿体色素提取液,第1只作为对照,第2只加入数滴5%HCl,摇匀,观察溶液颜色变化.当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,并微加热.与对照比较,观察溶液颜色变化.
【实验结果】
1、纸层析分离叶绿体色素
2、叶绿体理化性质的观察
1）荧光现象的观察
溶液的透射光为绿色，反射光为暗红色。
因为叶绿素吸收光量子而转变为激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
2）皂化作用
溶液分为两层，下层溶有皂化的绿色的叶绿素a和叶绿素 b(以及少量叶黄素)，上层溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
3）叶绿素分子中Mg2+的取代作用
a．经水浴加热后的溶液颜色变为深绿色，比对照试管中的溶液颜色更深。
b．经水浴加热后的溶液颜色先略微变黄，然后变为深绿色。
因为叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而呈褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为很稳定的铜代叶绿素，其在光下不易被破坏。
【讨论】
有什么作用?
1.研磨提取色素时加入CaCO
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加入CaCO
能使叶绿素中的一些成分在研磨时不受破坏。
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2.哪些条件会影响实验结果?
1）叶绿体色素提取液的保存条件
2）试剂的浓度以及用量
【参考文献】
1. 杨善元. 关于测定叶绿素含量及a:b值等若干问题，植物生理学通讯，1983（4）：61-6
2.
2. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts polyphenoloxidase in beta vulgaris. Plant Physiol., 1949, 24：1-15.
3. Bruinsma J. The quantitative analysis of chlorophylls a and b in plant extracts. Photochem Photobiol., 1963, 2：241-249.。