6、激素和生长因素
合成培养基的优点：来源方便，标准化产品； 缺点：不能完全满足细胞的生长需求，通常还需要加入一定量 的天然培养基予以补充。
动物细胞的培养方式
⒈ 悬浮培养 让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。 ⒉ 贴壁培养 让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。 ⒊ 贴壁-悬浮培养 ⑴ 微载体培养 ⑵ 包埋和微囊培养 ⑶ 结团培养
理想微载体：
表面性质与细胞相容性好，适合附着、伸展、增殖
材料无毒性 惰性材料，不与培养基反应、不吸收营养
比重1.030-1.045g/ml，搅拌悬浮、静止沉降
溶胀后粒径60-250μm，差异不大于20μm 光学透明性好
基质软性，减少搅拌时损伤细胞
可耐1200C高温 经简单处理后可反复使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
原料充分、制作简便、价廉
B、悬浮型或非贴壁依赖型
非依赖型细胞能以悬浮的、游离的形态 进行深层培养。来源于血液、淋巴组织 的细胞和其他转化细胞均属于这一类型 细胞，可采用类似于微生物培养的方式 进行悬浮培养。悬浮培养时细胞呈圆形。
二、动物细胞系的获取和建立
游离动物细胞的制备 杂交细胞的获得 通过细胞融合技术，可将高效表达目标蛋白的异源 细胞的遗传物质转移至所选择的可快速增殖的亲本细胞 中，获得杂交细胞。 PEG诱导融合和电场诱导融合是目前常用的细胞促 融手段。 杂交细胞的筛选 筛选的机理是：将细胞融合后所得的各类型的细胞 混合物接种于选择性培养基上，终止同型双核或多核融 合子、异型多核融合子及未融合亲本细胞的繁殖。 目前最常用的筛选系统（或方法）有：HAT筛选系 统、抗药性筛选系统和营养互补筛选系统。
培养基
B、血清
1、常用血清：
小牛血清、胎牛血清、马血清、人血清
添加血清有助于细胞贴壁和生长。 2、血清提供的主要成分： 蛋白质、多肽、激素、代谢物和营养物、无机物
天然培养基的优点：营养成分丰富，培养效果好； 缺点：来源有限，成分复杂，个体差异大。
培养基
C、合成培养基
1、氨基酸 2、维生素 3、盐 4、葡萄糖 5、有机添加剂
非常复杂 较复杂 慢，倍增时间 慢，倍增时间 为15－100小 为24－74小时 时 内部、激素 内部、激素
动植物细胞培养和微生物培养的比较（续）
比较项目
微生物
哺乳动物细胞 非常敏感，仅 忍受很窄范围
植物细胞 能忍受广泛范 围
环境敏感性 细胞分化
剪切力敏感 传统变异、 筛选技术 细胞或产物 浓度
能忍受广泛范围 无
四、影响植物细胞培养的因素及优化策略
植物细胞培养基的组成
与动物细胞培养不同，植物细胞可在简单合成培养 基上生长。 （1）碳源
（2）有机氮源
（3）无机盐类 （4）植物生长激素 （5）有机酸 （6）复合物质
影响植物细胞培养的因素
（1）细胞的遗传特性 （2）温度 （3）pH值 （4）营养成分
（5）光
3、贴壁-悬浮培养
（1）微载体培养
扩大贴附面积、保持悬浮状态
葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类
动物细胞微载体培养技术
贴壁依赖型细胞在微载体表面上的增殖，要经历粘附 和贴壁、生长及扩展成单层3个阶段。 提高细胞与微载体表面的相溶性，是提高细胞贴壁速 率和贴壁比率的必要条件。动物细胞在生理pH条件下 通常带负电荷，微载体需采用特殊处理技术使颗粒表 面带正电荷，具可润湿性。 用血清蛋白或合成蛋白、聚糖氨酸等物质包被于微载 体表面，可以促进细胞贴壁。 微载体有实心微载体和大孔微载体两大类。大孔微载 体培养动物细胞类似于包埋培养，细胞在孔内生长， 具有很高的安全性，搅拌引起的剪切损伤已不成为主 要考虑的因素。
一、动物细胞的类型
动物细胞的形态
A、贴壁依赖型
依赖型细胞的生长繁殖需要一个固体支撑物。体外培养时，依赖型细胞 通过改变表面形态形成称为“假足”的突出物，借以吸附在培养器皿内 壁或其他固体支撑物上。大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多 异倍体细胞和原核细胞均属此类型。
1、成纤维细胞（fibroblast 或mechanocyte type) 2、上皮细胞（epithilium cell) 3、游走细胞（wondering cell） 4、多形性细胞（polymorphic cell)
（3）植物细胞在培养中后期（对数生长期的 中后期）易凝集成为较大尺寸（300～400 μm） 的团块。细胞表面高分子粘性物质的存在是形 成细胞团的原因。细胞团的产生和生长使培养 液的流变学特性发生改变，培养液表观粘度增 大。 （4）植物细胞的培养过程通常为好氧过程。 植物细胞代谢所需的氧量低于微生物，适当地 控制供氧速度是保证植物细胞生长和产物代谢 的重要条件。
定特征的细胞株。
二倍体细胞有正常细胞的特点
①染色体组型是 2n 核型；
②贴壁依赖接触抑制；
③可传代培养50代；
④无致瘤性。
3、转化细胞系
通过某个转化过程形成的，常由于染色 体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点， 而获得无限增殖能力。 转化过程可以是自发的、人工的、从动 物肿瘤组织中建立。
4、融合细胞系
（6）搅拌和通气 （7）前体 （8）生长调节剂
愈伤组织器官发生途径
小 麦
芽分化 愈伤组织
再生苗
二、植物培养过程特性
植物细胞悬浮培养特性： （1）植物细胞的外形比微生物细胞大得多， 一般直径约30～100 μm，有纤维素细胞壁。 植物细胞虽有较强的抗张强度，但抗剪切能力 较弱，搅拌引起的高剪切力易损坏植物细胞的 结构。 （2）植物细胞生长速度慢，对数生长期中细 胞倍增时间通常为30～72 h。培养过程易染菌， 常在培养基中添加抗生素。
植物细胞培养技术
概述
植物组织和细胞培养 幼苗及较大植株的培养—植物培养
外植体增殖形成的愈伤组织培养—愈伤组织培养
离体细胞或较小细胞团的液体培养—悬浮培养
离体器官的培养—器官培养
胚胎的离体培养—胚胎培养
一、植物细胞的获取
外植体的选择：外植体的选择取决于研究或生产的目 的。必须正确地判断植株中合成所需的次生物质的主 要部位。 外植体的消毒与接种：消毒剂的选择及处理程序需依 外植体对消毒剂的敏感程度而定。次氯酸钠、过氧化 氢、高汞等消毒剂可供选用。 愈伤组织的生成：培养基中含有适量的生长调节物质 。 细胞株的建立：从愈伤组织得到游离细胞和小细胞团， 筛选并建立优良的单细胞无性繁殖系。 高产细胞株的筛选：筛选目标产物合成速度快的突变 株。
低 广泛使用 较高
有
非常高 不常使用 低
有
高 有时使用 低
四、动物细胞的大规模培养及过程控制
培养基
A、物理性质
1、pH值： 正常成纤维细胞：pH7.4—7.7；转化细胞：pH7.0—7.4。
酚红的呈色：
pH 呈色 6.5 黄色■ 7.0 橙色■ 7.4 红色■ 7.6 红带蓝■ 7.8 紫色■
2、温度 不同来源的动物细胞，其最适生长温度不同。 人和哺乳动物的最适生长温度是37 ℃，而昆 虫细胞的最适生长温度为25～28 ℃。动物细 胞的培养温度必须严格控制，允许波动范围在 ±0.25 ℃之内。 3、通气与搅拌 溶解氧是细胞代谢所必需的。动物细胞培养过 程中溶氧浓度必须适中，溶氧浓度过高可能对 细胞产生毒害作用，但当溶氧浓度过低时，又 成为细胞生长的限制因素。
1、悬浮培养 适合非贴壁依赖细胞、兼性贴壁细胞 操作简便、培养条件均一、传质和传氧较好、 易扩大培养规模 细胞体积小、难采用灌流培养、细胞密度低 通气搅拌罐式与气升式生物反应器
2、贴壁培养 适合贴壁细胞、兼性贴壁细胞 优/缺点与悬浮培养相反 在传代或扩大培养时需要酶将细胞从基质上 消化下来（胰酶、二乙烯四乙酸钠/EDTA、胰 酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链霉蛋 白酶、木瓜酶等）
2.3 动物细胞培养技术
1962年，实现了仓鼠肾细胞（BHK）的 大规模培养，这一成果标志着动物细胞 大规模培养技术的成熟与商业应用时代 的开始。 1975年，成功融合了小鼠B淋巴细胞和 骨髓瘤细胞，构建了能生产特定单克隆 抗体的杂交瘤细胞系。 1986年，首次成功地用微囊化技术大规 模培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体。
三、植物细胞培养方式
分批培养法：可实施两阶段培养的优化策略，第 一阶段以植物细胞最大增殖为主要控制目标，第 二阶段以次生物质最快合成为主要控制目标。 补料分批培养法：在对数生长期中后期，流加营 养物和/或前体物质，维持培养液中目标产物合成 所需的组分对于提高次生物质的生成速度是必要 的。采用半连续培养法，可延长产物合成期，有 利于提高目标产物的产率。
仙台病毒融合法 聚二乙醇融合法 电融合法
三、动物细胞培养特性
动植物细胞培养和微生物培养的比较
比较项目 大小 悬浮生长 营养要求 生长速率 代谢调节
微生物 1－10μm 可以 简单 快，倍增时间为 0.5-5小时 内部
哺乳动物细胞 10－100μm
植物细胞 10－100μm
可以，但易成 多数细胞需贴 团，无单个细 壁生长 胞
生产用动物细胞的要求
原代细胞
二倍体细胞系
转化细胞系
1、原代细胞 是直接取自动物组织器官经过粉碎消化而 获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、 淋巴细胞。
2、二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞
成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一