变性淀粉PPT代替昂贵得葡聚糖。 2. 双水相萃取技术同其他分离的结合，提高分离效率 与亲和层析相结合——亲和双水相
同生物转化相结合
习 题
凝聚： 絮凝： 分配系数（液液萃取）： 分离因数： 说明超临界流体萃取的优势有哪些？ 说明双水相萃取的优势有哪些？
H2O加量 次数 （g）
(NH4)2SO4溶液 加量 ml g
纯 溶液累计 PEG 400 (NH4)2SO4 总量（g） （%） 累计量
(NH4)2SO 4（%）
1 2
0.5 0.5
3
4 5 6 7 8
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
根据聚合物的质量平衡 ： mO mB mT 式中mO , mT 和mB分别为聚合物的总质量 和在上相和下相中的质 量，它们分别为： mO （VB B VT T） cO mB VB B cB mT VT T cT 式中V , 和c分别为相体积、密度和 聚合物的浓度； 下标O、T则分别代表在有机混合 物（O）、下相（B）和上相（T）中。 V c c 可以得到：T T B O VB B cO cT cB cO MB 从相图可知： cO cT MT 综合方程式，得 VT MB B VB MT T
不相溶性是一普遍现象，其溶剂也不一定是水，也可 能是有机溶剂。 如果多种不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相体 系，如硫酸葡聚糖、葡聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二 醇相混时，可形成四相体系。
与溶剂萃取比较，双水相的两相性质差别小（密度和 折射率），有时难以看到界面。
生化工程中广泛应用的双 水相体系：聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖(Dex)体系， PEG/盐等体系。 分离某一生物大分子，两 相系统的选择必须有利于 目的物的萃取和分离，同 时又要兼顾到聚合物的物 理性质。如甲基纤维素和 聚乙烯醇，因其粘度太高 而限制了它们的应用。
双水相萃取技术
萃取是最常用的一种液液分离方法，在制药和化 工行业应用极为普遍。但是普通的有机溶剂萃取法由 于以下原因难于应用于蛋白质分离： (1)许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶 剂；
(2)蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可 溶 性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶 液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有 大部分琼脂(或可溶性淀粉)。 60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A等人首先将双 水相系统应用于萃取技术。 70年代，德国将此技术应用于从细胞液中提取酶和蛋 白质，大大改善了酶的提取效果。 目前，仍然停留于实验室阶段，没有一套完善的理论 来解释生物大分子在体系中分配机理。工业化的例子 不多，原因在于成本过高，使技术上的优势被削弱。
pH微小的变化有时会使蛋白质的分 配系数改变2-3个数量级。
(4)体系温度的影响
温度影响相图，同时影响分配系数和蛋白质的生物活 性，它主要是影响相的高聚物组成。临界点附近，温度对 分配率的影响较大。远离临界点时，影响较小。 一般地，双水相萃取主要在室温附近操作。
(5)体系中微生物的影响
对于双水相体系，微生物 也会影响体系上下相的比例以 及胞内蛋白质在体系的分配系 数。 这种分配的差异主要是由 细胞破碎程度引起的，细胞壁 和细胞膜不同的化学结构也会 导致体系上下比例的改变。
PEG和Dex团其无毒性和 良好的可调性广泛应用。
二、相平衡和混溶性
T′
相 图
M′
A
B
B′
相图的制作
精确配制 43.00% （ g/ml ）左右的 (NH4)2SO4 溶液，并测其 密度。
精确称取PEG 400溶液0.700g 于试管中，按表格中所列第 一号数据，用吸管加入 0.5 mlH2O（ H2O的密度以1g/ml计） 缓慢滴入已配制好的 (NH4)2SO4 溶液，并不断在混合器上 混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现混 浊为止。记录 (NH4)2SO4 的加量（ ml ），根据密度值求出 重量（g），然后，按下表所列的第2号数据加入H2O，使 其澄清（加H2O量根据数据点的密集程度控制），继续向 试管中滴加 (NH4)2SO4 溶液，使其再次达到混浊，如此反 复操作，计算每次达到混浊时， PEG 和 (NH4)2SO4 在系统 总量中的重量百分比（%），将PEG的百分浓度为纵坐标， (NH4)2SO4 的百分浓度为横坐标作图，即得到一条双节线 的相图。
M′ T′
A
B B′
VT MB VB MT
CT
Co

物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分 配系数K 表示。
K ct cb
ct , cb分别为上相和下相中溶 质（分子或粒子）的浓 度。 当相系统固定时，分配 系数为常数。
K——与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关， 与溶质的浓度无关
匀浆液
PEG-Dextran系统 分离
下相（细胞粒子、杂蛋白、 核酸、多糖）
上相（产物） +盐
PEG-盐系统
分离
下相（产物）
上相（PEG、杂蛋白）
双水相萃取技术的发展
1. 廉价双水相体系的开发
两种双水相体系的比较
体系
PEG/DEX PEG/盐
优点
盐浓度低，活性损失小 成本低，粘度小
缺点
价格贵，粘度大，分相困难 盐浓度高，活性损失大
随着细胞浓度的增 加，细胞 破碎后释放的内含物的分配 系数迅速下降。
同时，PEG是一种常见的絮凝剂和沉淀剂，在该体系中， 细胞物质的絮凝和在不同相中的分配同时发生。所以PEG 的存在改变了物质的溶解曲线。
双 水 相 萃 取 技 术 的 应 用
要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件：
(1)欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中； (2)酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时 一次萃取，就能得到较高的收率； (3)两相用离心机很容易分离。
一、双水相的形成
高聚物水溶液的混合
互不溶性，形成两个水 相，两种聚合物分别富 集于上下两相； 复合凝聚，也形成两个 水相，但两种高聚物主 要集中于一相。另一项 几乎为水； 完全互溶形成均相的高 聚物水溶液。
一、双水相的形成
双水相形成机理
双水相系统的形成在于聚合物的不相溶性产生的空间障碍 作用。 两个亲水成分的非互溶性，通常来源于各自分子结构上的 不同所产生的相互排斥作用。相反两种高聚物如果产生引 力则会形成互溶或者复合凝聚。 双水相系统也可由聚合物和无机盐之间。只要浓度达到一 定值，也 会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理 尚不清楚，一 种解释为“盐析”作用。
双水相萃取法是利用物质 在互不相溶的两水相间分配系 数的差异来进行萃取的方法。 双水相系统可将水溶性的酶、 蛋白质等生物活性物质从一个 水相转移到另一水相中。
2.2％的葡聚糖水溶 液与等体积的0.72％ 甲基纤维素钠的水溶 液相混合并静置后， 可得到两个粘稠的液 层，下层含有大部分 葡聚糖．上层含有大 部分甲基纤维素纳， 两相中 98％以上的 成分是水。
pH=6.9 溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电。
KCl K Na
此性质常被用于提高 物质在双水相系统的 分配系数。
(3)体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可离解基团的离 解度，因而改变蛋白质所带电荷和 分配系数；另外，pH还影响系统缓 冲物质磷酸盐的离解程度，影响相 间电位差，从而影响分配系数。
影响分配平衡的参数
影响分配平衡的主要参数有成相聚合物的分子量和浓度、体 系的pH、体系中盐的种类和浓度、体系中菌体或细胞的种类 和浓度、体系温度等等。选择合适的条件，可以达到较高的 分配系数，较好地分离目的物。
(1)聚合物的影响
(2)体系中无机盐离子的影响 在PEG/DEX体系中，无机盐离子在两相中也有不同 的分配，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中 性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产 生很大的影响。