2.3.3.2 双水相萃取过程
包括： 双水相的形成 溶质在双水相中的分配 双水相的分离。
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2.3.3 双水相萃取操作及特点
萃取一般操作
固体聚合物 盐
加入
细胞匀浆
搅拌
成相物质溶解
形成双水相
蛋白质在两相中发生物质传递，达到分配平衡； 采用离心沉降进行相分离。
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均相区 双节线
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B 临界点
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
双
T’
水
相
体
系
单相
的
相
图
K 临界点
•N
TKB 双
节线
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双相 节线
M’
B’
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
M点, 两相T和B的量之间的关系(体积)服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
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2.3.3 双水相萃取操作及特点
2.3.3.1 双水相系统的选择
选择原则： 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子
质量、等电点和表面电荷等性质上的差别 综合利用静电作用、疏水作用,添加适当种类和浓度
的盐，可选择性萃取目标产物。
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2.3.3 双水相萃取操作及特点
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本节要点及学习要求
双水相体系的形成与分配机理 掌握： 双水相萃取分离的原理
双水相体系中的分配平衡：静电作用、疏水作用。
了解：
聚合物的不相溶性、系线、双节线、临界点。 影响物质分配平衡的因素：
双水相中聚合物组成的影响； 双水相系统物理化学性质的影响； 盐和缓冲液的影响；温度的影响。
双水相系统的应用。
2.3.2.2 影响分配系数的因素分析 1）成相聚合物 ---相对分子质量和浓度影响分配平衡.
对于成相聚合物系统和生物大分子来说：
A 聚合物的分子量降低
生物大分子该相溶解度增大
形成双水相所 需的浓度越高
上相分子量降低
B 成相聚合物的浓度越高
两相体系距离临界越远
分配系数增大。
分配系数
增大
下相分子量降低
2.3 双水相萃取
双水相体系是怎样形成的？ 其分配机理是什么？ 什么双水相萃取？ 双水相体系的相图？ 双水相萃取的原理是什么？ 特点是什么？ 影响双水相萃取体系的因
素有哪些？ 其应用范围是什么？
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2.3.1双水相体系的形 成与分配 2.3.2双水相萃取分离 的原理 2.3.3双水相萃取体系 的影响因素 2.3.4双水相萃取操作 及特点 2.3.5双水相萃取的应 用
先得到一浑浊不透明溶液，随后分为两相, 水相也可以分为
两相，即双水相系统 ?
将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另 一个水相中__双水相萃取.
开始于本世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激素、 病毒等分离提纯。近年来出现的引人注目、极有前途的新型 分离技术。
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
(2)双水相体系
亲水性高分
水
子聚合物
明胶-琼脂水溶液混合 明胶-淀粉水溶液混合 葡聚糖-甲基纤维素
水溶液 在一定浓度范围
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密度不同两相
两相均含有
较多的水
双水相
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
举例
向水相中加入高分子化合物PEG/葡聚糖或盐，在 一定组成范围内，可以形成密度不同的两相。
2.3.1 双水相体系的形成与分配
几种典型的双水相系统
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
各 种 双 水 相 体 系
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
(3)双水相体系的类型
双聚合物体系 聚合物与无机盐体系 表面活性剂-表面活性剂
常用PEG/Dx 如PEG/磷酸钾
影响蛋白质的表面疏水性，
改变各相成相物质组成和相体积比.
分配系数随盐浓度增加而增加,不同蛋白质
增加不同.
PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重
相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子
在上、下相中的分配平衡随添加
NaCl浓度的增大而改变。
调节双水相系统的盐浓度，可 有效萃取分离不同的蛋白质
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富含不同聚合 物的两相
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
(5)双水相萃取分离的原理
生物分子在双水相体系中的选择性分配 分配规律服从能特特分配定律. 与溶剂萃取比,表现出更大或更小的分配系数.→相图
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
双水相体系的相图 a
T 系线
两相区
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蛋白质下游加 工中比较独特
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2.3.4 双水相萃取的应用
可用于多种生物活性物质的分离纯化 1）酶的提取和纯化 酶主要分配在上相，菌体在下相或界面处.
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2.3.4 双水相萃取的应用
表5-7双水相萃取体系从微生物的破碎细胞中提取分离酶的实例
p8新4型分离技术
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2.3.4 双水相萃取的应用
收率为81％
从E.coli中提取hGH的三级错流萃取
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2.3.4 双水相萃取的应用
4）β干扰素（ β-IFN)的提取 不用PEG/Dextran体系 用PEG－磷酸酯/盐的体系才能使β-IFN分配在上相，杂
蛋白分配在下相。
基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
双水相萃取技术
(two-aqueous phase extraction,ATPS)
又称水溶液两相分配技术
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
技术诞生
明胶-琼脂水溶液混合
1896年Bei jerinck观察到 明胶-淀粉水溶液混合
系数影响因素
pH值
温度 双水相系统的选择
双 双水相萃取操作及特点 双水相萃取过程
水 相 萃
双水相萃取的应用
双水相萃取的特点
细胞碎片和蛋
流程 双水相组成的选择
取
白质分离纯化 增大收率应考虑的因素
双水相体系与生物转化相结合
双水相萃取同其 双水相萃取同膜分离技术相结合 它分离技术结合· 双水相萃取同亲和层析相结合
方法
目标产物与杂蛋白的等电点不同， 调节系统pH值，添加适当盐，产生希望的相间电位。 目标产物与杂蛋白的疏水性不同－充分利用盐析作用 增大成相系统浓度－使细胞碎片选择性分配于下相。 采用相对分子质量较大的PEG 降低蛋白质的分配系数，提高目标蛋白的选择性。
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2.3.3 双水相萃取操作及特点
(2)常温下溶液粘度较低，容易相分离； (3)常温操作节省冷却费用。
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2.3.2双水相萃取体系的影响因素
5)低分子量化合物:高浓度时起作用。
6)双水相体系物理化学性质的影响： 双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数： 密度(ρ)和两相间的密度差 黏度(μ)和两相间的黏度差以及表面张力(σ) 相间电势差,相分离时间等。
双水相萃取与细胞破碎的结合
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2.3.2双水相萃取体系的影响因素
3）pH值
改变
pH值
影响
蛋白质的表面电荷数 改变
分配系数
磷酸盐的解离
影响
系统的相间电位和 蛋白质的分配系数。
4）温度 温度影响相图, 规模化操作采用常温, 一般双水 相系统来说，温度的影响很小。
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2.3.2双水相萃取体系的影响因素
重点：
双水相体系的形成与分配机理， 双水相萃取分离的原理和特点。
难点： 双水相体系的形成与分配机理。
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2.3.1 双水相体系的形成与分配
(1)概述：
基因工程产品如蛋白质和酶的特点: 活性和功能对pH值、温度和离子强度等特别敏感； 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性。
传统的溶剂萃取法并不适合。反胶束的办法可克服这些 问题，但存在大量使用有机相和相的分离问题。
分配系数 降低
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2.3.2双水相萃取体系的影响因素
2）盐的种类和浓度 ---主要影响相间电位和蛋白质疏水性。
在双聚合物 双水相系统中
无机离子分配系数 相间电位不同
盐种类
影响带电蛋白质、核酸生 物大分 子的分配系数
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2.3.2双水相萃取体系的影响因素
盐浓度
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2.3.4 双水相萃取的应用
2）核酸分离纯化 用PEG/Dextran体系萃取核酸时，盐组分的微
小变化将会引起分配系数的微小变化。
3）人生长激素的提取
用PEG4000 6.6%/磷酸盐14％体系从E.coli 碎
片中提取人生长激素（hGH) （hGH)分配在上相，分配系数6.4，收率60％.
亲和配基-高聚物, 亲和双水相萃取