植体浸入15～30秒种即可起到消毒作用
• 由于酒精对组织细胞的杀伤力比较强,使用 时间不能过长,一般达不到彻底消毒的要求， 但酒精的浸润作用可以促进其它消毒剂渗 透到外植体的整个表面，提高杀菌效果， 常做为外植体消毒的第一步
次氯酸钠（NaClO）
• 可以分解释放Cl2,具有较强的杀菌作用,对 植物细胞的损伤较小,消毒时间10min左右 为宜(2NaClO+H2O+2CO2 =2NaHCO3+ Cl2)
• 鳞茎：百合、大蒜等。且鳞茎的不同部位 的再生能力有很大的差别，外层比内层鳞 片叶的再生能力强，同一鳞片下段比中上 段再生能力强
其它 • 子叶或下胚轴 • 胎座 • 胚珠 • 种子 • 花瓣 • 花药和花粉
• ……
因此，选择合适的部位和组织（最 能表达全能性），是决定组织培养 成功的前提之一
⑶外植体的大小
一般来讲，较大的外植体有较大的再生能力
许多植物的茎尖培养表明，材料越小，成活率越 低（临界大小一般为一个茎尖分生组织带1～2个 叶原基）
但也不能过大，过大则难以消毒灭菌，容易引起 污染
一般愈伤组织诱导，可将材料切成5mm小段或 5mm×5mm小块
脱毒培养在保证存活的前提下应尽量小（0.1～ 0.2mm）
长状态已脱离分化状态，重新恢复分生能 力，即脱分化 ⑵继代培养 也称传代培养，指愈伤组织在培养基上生 长一段时间后，营养物枯竭，水分散失， 并已经积累了一些代谢产物，此时需要将 这些组织转移到新的培养基上
水稻幼穗
愈伤组织
⑶分化培养
愈伤组织的再分化过程
⑷生根培养
在生根培养基 (with relatively higher auxin/cytokinin ratios) 上进行根的诱导
⑸组培苗的炼苗
试管苗在进入自然环境前必须炼苗，进行适 应训练，此步骤也十分关键
打开培养瓶，加入少量蒸馏水，在一定的温 度和湿度条件下炼苗2～3天
⑹移栽和驯化
炼苗后，洗净试管苗根上的琼脂，将幼苗移 栽至驯化苗圃中驯化。驯化应在能够有效控 制温度、湿度的驯化温室或大棚中进行，每 天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，15～ 20d
第三节 外植体的取材与培养
第三节 外植体的取材与培养
一 外植体的选择 二 外植体灭菌 三 外植体的接种及培养 四 培养中的常见问题及对策
原生质体培养
一、外植体的选择
1.外植体的概念
外植体（explant）： 用于离体培养的活的植 物组织、器官等材料， 是植物离体培养的基础 材料。（Ex-plant离开 植物体的一部分）
2.外植体的来源
生长在自然环境中的植物 控制环境条件下生长的植物 无菌环境下已经离体培养的植物
3.外植体的选择
不同植物以及同一植物各个不同部位的组 织、器官，其形态发生能力都可能因植株 的年龄、季节及生理状态等而有很大不同
根据培养需求，应选取最易表达全能性的 部位做为外植体，从而增加成功的机会
甘蔗培养材料大小对分化的影响
品种 川蔗11号 桂糖2号 桂糖71/114
愈伤组织 大小
（mm） ﹤5 ﹥5 ﹤5 ﹥5 ﹤5 ﹥5
愈伤组 织数
102 65 69 105 56 68
出苗数
芽分化率 （%）
9
8.8
48
73.8
8
11.6
87
82.6
7
12.5
64
94.1
二、外植体的灭菌
㈠外植体消毒灭菌的要求 包括两个方面： 把外植体上的一切微生物，包括营养体、
Effect of cutting and leaf age Adventitious shoot regeneration from leaf explants of Gypsophila paniculata L.(宿根霞草)
Callus began to accumulate on both adaxial and abaxial sides and after 12–15 days of culture
70%酒精
外植体放入 灭菌的小烧杯(三角瓶等)中
15-30秒
加入消毒剂(氯化汞或次氯酸钠等)
迅速倒出酒精
5～20分钟（振摇
加入无菌水
数次） 倒出消毒剂
振摇数次将水倒掉(反复3～5次)
㈢不同材料的消毒方法
种子
• 清洗：将种子用自来水冲洗20min
• 酒精处理：70-75％酒精处理0.5-1.0 min， 立即除去酒精
2.培养类型（按培养材料层次）
植 株培养 器 官培养 组 织培养 胚 胎培养 细 胞培养 原生质体培养
植株培养 指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和 较大的植株）作为外植体的无菌培养
器官培养 指以植物的根、茎、叶、花、果实等器官 为外植体的离体无菌培养
组织培养 指以分离出植物各部位的组织（如分生组 织、成熟组织），或已诱导的愈伤组织为外 植体的离体无菌培养（这是狭义的组织培养）
驯化大棚
4.培养条件的控制
光照 温度 湿度 培养基pH 气体调节
光照
• 光照包括：时间、强 度和光质；
• 光照时间影响植株再 生状态
• 光照强度应植物类型 不同而异
• 光质研究报道较少
温度
• 常用温度范围一般在20～30℃ • 低于15℃或高于35℃均会影响培养物的生
长 • 适宜的温度有利于细胞分裂；适当提高温
• 注意须防潮,要求密封储存,随配随用
氯化汞(HgCl2) • 原理:具有剧毒的重金属盐杀菌剂,其Hg2+
可与带负电荷的蛋白质结合,使微生物菌体 蛋白变性而失活
• 缺点:对植物组织的损伤较大,且不易被无 菌水洗去,对人体也有毒害作用
• 优点:消毒效果好,且稳定,能长期保存
外植体消毒的一般程序
褐化
玻璃化
1.污染
细菌污染
• 现象：外植体周围形成细菌膜，逐渐产生粘 液或浑浊的水迹，并进一步在外植体与培养 基接触处产生气泡，时间长了会出现乳白色 或橙黄色的菌落，呈圆形并很快扩大
胚胎培养 指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚 为外植体的离体无菌培养
细胞培养 由愈伤组织培养而成的悬浮细胞（游离的 花粉粒，分离的卵、精子、细胞、合子等）
原生质体培养 指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离 体无菌培养
3.培养的基本程序
⑴愈伤组织诱导培养 愈伤组织的形成标志着接种的外植体的生
接种器械(解剖刀、镊子等)的消毒方法： 将金属器械蘸入95%酒精中，取出后再置于 酒精灯火焰上灼烧，待冷却后即可使用(每 完成一次接种操作后需消毒一次)
切取 接种
外植体接种的原则
• 接种数量 一般材料每瓶3～5个；贵重或稀少的材料，
切勿用大的培养瓶，应用小三角瓶或试管， 每瓶只接种1～2个外植体 如果用大的培养瓶，一般可接种10个外植体, 但只要其中一个发生污染，由于培养基表面 水的流动,全瓶外植体都将被污染
Multiple shoot formation on the explants after 35 days in culture.
Rooting of an elongating adventitious shoot.
Regenerated plants established in soil
Effect of cutting and leaf age on the percentage of leaves forming shoots (LFS) and the average number of shoots per leaf (AS) produced from cv. Arbel. Overall efficiency (OE) of shoot regeneration from leaves. Regeneration efficiencies were evaluated following a total of 42 days in culture on medium
• 外植体只有一部分表面可以接触培养基，当 外植体周围的营养被吸收后，容易造成培养 基中营养物质的浓度差异，影响培养物生长
• 外植体插入培养基的部分，常因气体交换不 畅以及有毒代谢产物的积累而影响组织的呼 吸或造成毒害
固体培养
solid culture
液体培养
• 静置液体培养 加滤纸桥 • 振荡液体培养
• 规律：老叶和幼嫩的小叶比成熟叶片难于 培养
• 幼嫩的小叶生理功能还不健全，分化能力 差；老叶生理功能已经衰退，难以分化
• 成熟叶片营养丰富，生理功能旺盛，光合 作用能力强，细胞处于活性状态，容易脱 分化和再分化
• 例：罗汉果、猕猴桃、番茄、矮牵牛等
茎
• 茎段：雪松、桉树、薄荷等
• 花茎：大花萱草等植物的侧芽在土中，极 易污染，而且分化能力很差，用花茎做外 植体时效果很好，细胞脱分化和再分化都 很快
度，则有利于细胞伸长；而在一定范围内 降低培养温度，则使细胞的质量增加
湿度
组织培养中湿度的影响有两个方面： • 一是培养容器内的湿度条件，几乎是100%
的相对湿度 • 二是环境的相对湿度，一般要求70～80%
pH
.0
气体
液体振荡培养的烟草愈伤组织生长与振荡次数的关系
四、培养中的常见问题及对策 污染
硝酸银 精
使用浓 度(%) 2～5 9～10
0.1～0.2
10～12 1～2
1 70～75
消毒时间 （min）
5～30 5～30 2～10 5～15 2～10 5～30 0.2～2
效果
好 好 最好 较好 好 较好 好
去除难易
易 易 最难 最易 易 较难 易
常用消毒剂的特性