细胞培养
Cell Culture
细胞培养基本技术
第四章 细胞培养的基本技术
4.1 基本操作技术和要求
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培养室内的无菌操作
培养前准备
制订试验计划和操作程序 准备各种器材物品
培养室和超净台的消毒
0.2%新洁尔灭托洗地面 紫外灯照射30-60分钟 以75%乙醇擦拭无菌操作台面
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无菌操作中常犯的错误
吸管、剪刀等碰到其他器皿
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无菌操作中常犯的错误
正确的拿管姿势
错误的拿管姿势
拿吸管时手碰到无菌区！
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无菌操作中常犯的错误
培养基浸湿吸管底部的棉花
组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、 骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。
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培养要点
材料新鲜 严格无菌操作 剔除脂肪等附着组织 组织块剪小（直径﹤1mm） 摆放开（间距﹥5mm）
消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化 间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代 细胞。
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55 20--60min
切成1--2mm3小块
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传代时不同的细胞有不同的消化时间，因 而要根据需要注意观察及时处理。
首次传代时细胞接种数量要多一些，使细 胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增 殖。
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两个概念
原代培养
直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次 的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的 细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。
传代培养
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞 消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称 为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转 化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。
格×稀释倍数 ×104
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原理：
（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计 数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方 形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使 用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即 为每ml中之细胞数目。
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4.3 传代培养和细胞系的维持
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传代细胞培养
细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作 叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培 养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。
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首次传代注意事项
细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分 表面以前（80%），不要急于传代。
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培养要点
36合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%） 合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜
色略白为止（通常为37℃，20-40分钟）
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常犯的错误
水浴锅未预热
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组织块太大
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常犯的错误
胰蛋白酶消化不足或过度
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吹打用力过重
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常犯的错误
操作中不换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多
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消化培养法
消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。 它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成 的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤 维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢 物
（3）存活测试之步骤为dye exclusion（染料排除），利用染料会渗入死细 胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般 使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红 色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞 数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分 活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含 血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
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培养室内的无菌操作
洗手和着装
彻底洗手 以75%乙醇消毒手和前臂 可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。
无菌培养操作
一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰 触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容 器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖 并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖 盖口朝上放置桌面。
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培养细胞的取材
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可 以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织 ）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组 织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容 易培养。
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组织块培养法
新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织 切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游 离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。
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4.2 原代培养
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细胞和组织培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为 培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿 底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基 。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞 计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入 培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立 即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。