分子克隆及细胞培养基本实验方法1.载体构建实用操作技术1.1菌种的保存—20%甘油菌2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。
（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可）1.2甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。
方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。
1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase）⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化）⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。
1.4酶切反应⑴体系构成（反应体系尽可能小！）pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）①dd.H2O 17 17②10×NEbuff 2 3 3③10×BSA 3 3④底物DNA 5 5⑤内切酶HindⅢ 1 1XbaⅠ 1 1Total : 30 ul 30ul⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全⑷65℃灭活内切酶⑸-20℃保存备用1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol）⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重；⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ulQG /100mg）；⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似；⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物量。
此步不离心。
DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量；⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）；⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm，1min，以去除剩余的乙醇；⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min；⑻-20℃保存备用。
1.6连接反应⑴体系构成（反应体系20ul，载体：目的片段=1：3-5，摩尔数比）反应组份数量（ul）①dd.H2O 8②T4 10×buff 2③载体ＤＮＡ（ul） 1目的片段（ul）8④T4DNA连接酶 1Total : 20 ul⑵16℃水浴12-16小时（过夜）⑶直接用于转化或-20℃保存备用1.7感受态细胞的制备⑴菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加Amp），37℃振摇4-6 hr，至中对数期；⑵菌液冰浴10min，分装2管，离心（4℃，4 000-6 000rpm）收菌；⑶弃上清，将菌体悬浮于800ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴10min，离心（4℃，4000-6000rpm）；⑷再将菌体悬浮于200ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴，12-24hr可用。
菌体沉淀时，重悬操作要轻。
1.8转化⑴新鲜感受态细胞200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min；⑵42℃热休克90sec，勿摇动试管，再冰浴2min；⑶加入液体LB培养基（无抗生素）800ul，37℃温和振摇45-60min；⑷离心4000-6000rpm，2min，弃去900ul上清；⑸剩余物重悬细菌，铺Amp板，平放20min，倒置培养10-14hr。
1.9鉴定重组子常规PCR法鉴定重组子（25ul反应体系，1ul菌液）或抽提质粒DNA酶切鉴定。
⑴PCR反应体系：试剂数量终浓度①dd.H2O 17.5 ul②10×PCR缓冲液 2.5 ul 1×③MgCl2（25mM） 1.5 1.5 mM④dNTPmix(2.5mM) 1 ul 50uM⑤上游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM下游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM⑥TaqDNA聚合酶(3U/ul) 0.5 ul 0.06U/ul⑦模板（菌液）1ul终体积25ul⑵PCR反应参数：94℃，5min；“94℃，30sec、50℃，30sec、72℃，1min”×20-30循环；72℃，6min；4℃，保存备用；⑶电泳鉴定，以挑选阳性重组子，注意阳性、阴性对照的设立。
2.大规模制备质粒DNA（QIAGEN Plasmid Maxi Protocol ）适于从100~250ml 菌液中制备100-200 ug高拷贝质粒⑴涂板挑取单克隆菌落，入LB选择性培养基，37℃振摇8hr后，取适量菌液（1/500-1/1000）入100-250ml LB选择性培养基（高拷贝100-250ml LB，低拷贝500ml LB），37℃振摇12-16hr；⑵收获菌液，4℃离心6 000rpm（6 000g）１5min，弃尽上清；注意：在此步可将菌（离心沉淀）冻存于-20℃，留待以后操作。
⑶以10ml P1重悬细菌（P1中已加RNase）；⑷加入10ml P2，颠倒4~6次轻混，室温放置5min（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化）；⑸加入冰预冷10ml P3，迅速颠倒4~6次轻混，冰上放置20min，以促进沉淀形成；⑹4℃离心13 000rpm（20 000g以上）30min（离心前，应再次混合样品）；上清入新管，再次离心13 000rpm（20 000g以上）15min；⑺第二次离心的同时，用10ml QBT缓冲液平衡QIAGEN柱，不需离心（重力引流）；⑻结合：快速移上清（第二次离心）入QIAGEN柱，使其在重力引流下进入树脂（resin）；⑼清洗：30ml QC洗2次（重力引流）；⑽洗脱：15ml QF缓冲液洗脱结合的DNA，将洗脱液收集入新管（可将洗脱液暂时存放于4℃数小时）；⑾沉淀：加入10.5ml 异丙醇（室温，以免增加盐沉淀），混匀，立刻于4℃离心9 500rpm（15 000g）30min（离心前在管底作好标记，此步重要！），小心缓慢地倒出上清（以免弃去DNA沉淀）；注意：此步如果DNA沉淀不可见，可以1.5ml 75%乙醇冲洗管底标记处，然后转移至1.5ml离心管，15 000 rpm（20 000g）30min，此时沉淀往往可见，可重复此步骤1次，以收集尽可能多的质粒DNA⑿再清洗：5ml 70%乙醇（室温，以免增加盐沉淀）洗，离心9 500rpm（15 000g）10min，小心缓慢地倒出上清；⒀空气中干燥沉淀5-10min ，以适当体积的TE,pH8.0 或10mM Tris-Cl, pH8.5 溶解DNA沉淀（注意冲洗管壁，过度吹打会剪切DNA应避免）；⒁琼脂糖凝胶电泳分析；⒂质粒DNA浓度测定（紫外分光光度仪），OD260/OD280=1.6~1.8。
3.细胞培养常规方法3.1 293细胞常规复苏、培养、传代及冻存⑴培养液配制：DMEM，加入NaHCO2 3.7g/L，庆大霉素8万u，调pH至7.0-7.2（比细胞生长所需终末pH低0.2-0.3），定容至1L，0.22um过滤分装即可；⑵293生长要求：DMEM，含2-10%的FBS（按不同实验对细胞生长速度要求的不同而不同）；⑶293细胞的复苏：取液氮中冻存的细胞1管，迅速置37℃水浴1-3min融化；转移至10ml离心管加入8ml DMEM 10%，轻轻吹打混匀，低速离心1000rpm，5min；弃上清，加入8ml DMEM 10%重悬细胞；转入25ml 培养瓶补足培养液，置CO2孵箱37℃、5% CO2培养；⑷293细胞的培养：DMEM 10%；⑸293细胞的传代（1：2-3）：弃培养液，NS或无血清培养液洗1-2次，加入适量（数滴，或1-3ml；按培养的293细胞代数而定，代数低时，胰酶适当多加，反之，可能数滴即可）0.25%胰酶消化液，37℃消化1-3min，镜下观察消化情况，待细胞变圆、脱离瓶壁时，轻轻拍打瓶壁，使细胞完全脱离，加入适量培养液轻轻吹打使之分散；转入10ml 离心管，低速离心1000rpm，2-5min；弃上清，加入适量DMEM 10%重悬细胞；转入适当大小培养瓶（1：2-3）并补足培养液，置CO2孵箱37℃、5% CO2培养；⑹293细胞的冻存：取生长对数期的培养细胞，常规消化、离心，细胞沉淀以1-2mlDMEM 10%重悬，计数；重悬细胞10% DMSO、40% FBS，以DMEM 10%补足体积，细胞终浓度为1×106/ml；转入冻存管1.5ml/Tube，封口膜封口，置-80℃冰箱24hr；次日将细胞转入液氮，长期保存。
3.2 L-O2细胞的培养⑴L-O2细胞生长要求：DMEM/1640（1：1）混合培养液，含5-10%的FBS（按不同实验对细胞生长速度要求的不同而不同）；⑵L-O2细胞的传代：比例1：3-5；⑶余基本同293细胞。
3.3细胞计数法⑴染色：常规消化、离心，弃上清，加入1或2ml培养液，轻轻吹打重悬细胞，吸20ul细胞悬液，加入760ul NS，加入20ul台盼蓝，混匀，置2-3min；⑵计数板：用96%酒精冲洗计数板后，用擦镜纸擦净，另擦净盖玻片1张，把盖片覆在计数板上，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；⑶加稀释液：滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；⑷镜检：计算四大方格内细胞数，压中线者只计算左线和上线者；⑸计算公式：细胞数=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数；本法：细胞数=4大格细胞总数×105；⑹按培养要求接种培养。