GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
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5.1 重组DNA技术发展史
▪ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。
▪ T4¯DNA连接酶 ▪ EcoR I 连接酶 ▪ T7¯DNA连接酶
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5.1 重组DNA技术发展史
▪ 基因克隆(gene cloning) ▪ 分子克隆(molecular cloning)
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 ①外源基因 ②载体 ③工具酶 ④受体细胞
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5.1 重组DNA技术发展史
2、重组DNA技术的基本步骤 ▪ ①目的基因的获得与载体的制备 ▪ ②目的基因与载体DNA的连接 ▪ ③重组DNA分子导入受体细胞 ▪ ④重组体的筛选与重组DNA的鉴定 ▪ ⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化
第五章 分子生物学研究方法
5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因表达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础
▪ 40年代明确了遗传的物质基础是DNA ▪ 50年代揭示了DNA 分子的双螺旋结构模型和半
酶类 限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ
反转录酶
多核苷酸激酶 末端转移酶 DNA外切酶Ⅲ λ噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
功能 识别并在特定位点切开DNA
通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个 DNA分子 按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中 的缺口 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合 成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端
▪ 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 ▪ 重组DNA技术缩短了进化时间 ▪ 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 ▪ 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，
从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶
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5.1 重组DNA技术发展史
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列 呈回文对称的序列。
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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5.1 重组DNA技术发展史
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸
切除位于D史
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
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5.1 重组DNA技术发展史
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
▪ 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.3重组DNA技术的概念
▪ 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁 殖，以获得该DNA的大量拷贝。
保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息 传递问题 。 ▪ 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵 子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明 了遗传信息的流向和表达问题。
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基
▪ 1、DNA分子的切割与连接技术
▪ 限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学 家有了进行DNA操作的基本工具。
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5.1 重组DNA技术发展史
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
限制酶消化
开环载体DNA
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
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菌落原位杂交
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.5重组DNA技术的意义
目的基因的来源
原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA天然DNA（染色体 DNA、病毒DNA(噬菌 体DNA)、质粒DNA、 线粒体DNA和叶绿体 DNA）
人工合成及PCR扩增目的基因
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5.1 重组DNA技术发展史
（八）重组实验中的主要载体 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖 或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。
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5.1 重组DNA技术发展史
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设
计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多
肽链而特意设计的载体称为表达载体。
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5.1 重组DNA技术发展史
载体的选择标准
▪ 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立
▪ 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。
▪ 能自主复制； ▪ 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选
和鉴定； ▪ 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一
酶切位点，称为多克隆位点； ▪ 分子量小，以容纳较大的外源DNA。