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一般流程
蛋白质样品的制备
SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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蛋白质样品的制备
从-20℃冰箱取出细胞液，室温溶解后， 3000rpm离心5min，吸去上清液，保留细 胞沉淀。每管加入一定量的上样缓冲液裂 解细胞，用手指轻弹以充分裂解细胞。充 分裂解后，煮沸10min，使蛋白变性， 12000rpm离心5min，取上清，测蛋白含量， 用的是TCA蛋白测定法测蛋白含量。
Western blot又成蛋白质印迹法，对单 项电泳后蛋白质分子的印迹分析称 western印迹法，它是分子生物学、生 物化学和免疫遗传学中常用的一种实 验方法,且能对蛋白进行定性和半定量
的分析方法。
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基本原理
Western blot是通过特异性抗体对 凝胶电泳处理过的细胞或生物组织 样品进行着色。通过分析着色的位 置和着色的深度获得特定的蛋白质 在所分析的细胞或组织中的表达情 况的信息。
Western blot 实验技术
2012.12.12
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Western blot的定义
Western blot的基本原理
Western blot的一般流程
Western blot的常见问题
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定义
印迹法（blotting）是指将样品转移到 固相载体上，而后利用相应的探测反
应来检测样品的一种方法。
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电泳步骤：
1.清洗玻璃板
2.灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂 直卡在架子上准备灌胶
（2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立 即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／ 3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶 凝的更快（30min）。
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（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时， 说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒 去上层水，并用吸水纸将水吸干。
5.将膜晾干备用。
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封闭
用5%的脱脂奶粉封闭液 （2.5g脱脂奶粉， 50mlPBST缓冲液）封闭， 在摇床上封闭一小时。
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一抗杂交
一抗稀释液：一抗，10ml PBST，0.1g脱脂 奶粉，30ul叠氮钠。用PBST稀释一抗至适当 浓度（一抗使用前要3000r／min离心3min）。
（4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED 后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓 缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩 胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直 向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好 拔）。
(5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液 后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃 板内侧）
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蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒， 它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的 大小成比例。
因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影 响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质 亚基分子量的大小。
当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移 率与分子量的对数呈线性关系。
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9Байду номын сангаас
SDS-PAGE电泳
基本原理： 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸 钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质 的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基 乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。
蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与 SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大 大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同 分子之间原有的电荷差异 。
1.转一张膜需要准备长8.0cm，宽5.5cm的六 张滤纸和一张硝酸纤维素膜。（切滤纸和 膜时要戴上手套，以免手上的蛋白会污染 膜）将切好的滤纸和膜至于转移缓冲液中 浸两小时才可使用。（使膜浮于转移缓冲 液上，只有下层才与水接触，这样由于毛 细血管作用才能把整个膜浸湿。）
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2.将玻璃板撬开，去掉小玻璃板。将浓缩胶轻轻 刮去，小心的剥下分离胶先放于转移缓冲液中。 （在撬玻璃板时要小心，因玻板易碎。剥离分 离胶时要注意不要弄破分离胶）
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（1）25mg/mL BSA的配制:
取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白
标
准(20mg BSA)中，充分溶解后配制
25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，
也以-20℃长期保存。
（2）1mg/mL BSA的配制:
取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用 1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL， 按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。
3.放置顺序：阴极-海绵垫-三层滤纸-分离胶-膜三层滤纸-海绵垫-阳极。（顺序不能反了，膜 盖上后不可移动，每盖一层，要用玻棒擀出其 中的气泡。第二、三步时戴手套，因转移缓冲 液中含甲醇，实验室要开门空气流通。）
4.把夹子放入转移槽中，黑面对对槽的黑面，白 面对槽的红面，转移时会产热用冰块降温。一 般150V，400mA转膜1：30h。
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（6）根据测出的蛋白含量，计算出含一定质量 蛋白的溶液体积即为上样量。上样前要将蛋白 于沸水中煮沸10min使蛋白变性，并12000r／ min离心5min。
3.电泳
在浓缩胶中电压可为80V，至溴酚蓝进入分离 胶后将电压转换为90V,电泳至溴酚蓝离下边缘 1cm处时停止电泳。
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转膜
将一抗稀释液倒入保鲜膜袋内，从封闭液中 取出膜用滤纸吸干残留液体，将膜放入一抗 稀释液中，膜蛋白面与抗体液面接触。室温 下脱色摇床20min,4℃过夜。次日用PBST缓 冲液室温脱色摇床上洗三次，每次10min。
（3）60% TCA工作液的配制:
取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水 中，即为60% TCA工作液，使用前配制。
（4）配制BSA标准系列和样品 如表格：
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蛋白样品 5μl，1×loading buffer 45μl， ddH2O 50μl，TCA 66.7μl，放置15-30min， 用酶标仪，λ=595nm处测定蛋白含量。