主要仪器
SHZ-82 型恒温振荡器 SKP-201B 型电热恒温箱 SBA-240C 型生物传感分析仪 FLC-23 型超净工作台 722S 型可见分光光度计 TD52-2 型自动平衡离心机 10 L 发酵罐
培养方法
种子培养 250 mL 三角瓶中装液量为30 mL ,接种后臵于 30 ℃、220 r 〃min - 1摇床培养18～20 h 。 摇瓶发酵培养 取孢子悬液接入发酵培养基中(250 mL 三角瓶中 装液量为30 mL) 臵于33 ℃、250 r 〃min - 1 摇 床 培养,发酵结束后测残糖及葡萄糖酸的浓度。 发酵罐发酵 10 L 发酵罐装料7 L ,接种10 %的黑曲霉种子悬 液,搅拌转速250 r 〃min - 1 ,无菌空气流量 0.4m3 〃h - 1 ,维持温度33 ℃,流加30 %的碱液 维持pH5.6 。残糖含量降至015 %以下时,结束发 酵。
葡萄糖酸的发酵生产
生工本0901 寇凤雨
葡萄糖酸的性质
• 葡萄糖酸是葡萄糖 衍生的糖酸,分子式 为C6H12O7。为结晶 状化合物，熔点 131℃,呈弱酸性， 溶于水，微溶于乙 醇。在水溶液中转 化为γ-葡萄糖酸内 酯和 δ－葡萄糖酸 内酯的平衡混合物。
• 葡萄糖酸作为蓬松剂、 凝固剂、鳌合剂、酸 味剂而广泛应用于食 品、医药、建筑等行 业，葡萄糖酸与钠、 钙、锌、亚铁等金属 氧化物合成制得的葡 萄糖酸盐可作为食品 添加剂和营养增补剂 添加到食品中。葡萄 糖酸的金属络合物在 碱性体系中广泛用作 金属离子的掩蔽剂。 • 葡萄糖酸钠可分为工 业级，食品级和医药 级目前我国市场价格 分别在4300-4800 /t， 7800-8500元／t， 8800-10000元／t。
E
•
cE ×V
葡萄糖含量的控制方式 葡萄糖在较高含量下,对许多微生物的生长和 代谢都有抑制作用,使菌体生长速率和产物生 成速率处于较低水平,发酵时间大大延长。 摇瓶实验 在葡萄糖含量分别为10 %、20 %和30 %的发 酵培养基中分别添加27 g 〃L - 1 、54 g 〃L - 1 、81 g 〃L - 1CaCO3 ,摇瓶发酵30 h ,考 察葡萄糖含量对黑曲霉产酸的影响,结果见表 2
菌种选育按照生产要求，根据微生物的遗传 和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异， 再经过筛选获得高产变株而达到提高发酵水 平的目的；而发酵工艺的优化是改变培养基 的在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅 拌转速、调节pH等措施，从而强化微生物的 生物合成的全过程，提高发酵产量。通过工 艺优化，改进发酵培养基成份和发酵条件， 创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件， 充分发挥菌种的生产潜力，从而显著提高发 酵产量
葡萄糖氧化酶酶活力的测定
本研究采用分光光度计分析法测定葡萄 糖氧化酶活性。反应混合液含2mL1mol/L 葡萄糖（0.1mol/L的柠檬酸钠-磷酸缓冲 液配制，PH=5.0)，1mL 0.1％苯醌和 100uL 粗酶液，反应液于35 ℃下保温反 应10min，于290nm 处测定形成的氢醌的 量。葡萄糖氧化酶的单位（U）定义为35 ℃ PH=5.0 下每克菌体每分钟产生 1umol氢醌的酶量。
山东凯翔生物化工有限公司专业从事葡萄 糖酸钠，葡萄糖酸内酯，衣康酸的研究、 开发、生产和销售，拥有先进的生物发酵 设备、一流的检测手段、现代化的科学管 理级雄厚的技术力量，并通过了ISO9001国 际质量管理体系认证、ISO14001国际环境 管理体系认证、OHSAS18001国际职业健康 安全管理体系认证。 公司年产葡萄糖酸钠35000吨，是国内最 大的生产供应商，生产的“凯翔”牌葡萄 糖酸钠，葡萄糖酸内酯各项技术指标均达 到国际先进水平，产品畅销美洲、欧洲、 东南亚、中东等国家和地区。
高产菌株的筛选
紫外线诱变取黑曲霉P-9的孢子，用无菌生 理盐水制成108个/mL的孢子悬液。取 2mL 孢子悬液于无菌培养皿中，铺成一层薄层， 于暗室内30w紫外灯下20cm处照射8min。取 照射液进行适当稀释，涂布于选择培养基， 用黑纸包裹，30℃恒温避光培养4d，待长 出孢子后，将孢子点种于筛选培养基，挑 选在菌落周围出现较大蓝色圈的菌株，分 别进行发酵并测定葡萄糖氧化酶活力。
蓝圈法的原理是微生物产生的葡萄 糖氧化酶将培养基中 的葡萄糖转化为葡 萄糖酸，葡萄糖酸与KI反应将I- 离子还 原为I元素，I与培养基中的可溶性淀粉 反应形成蓝色化合物而使菌落周围出现 蓝色圈，蓝色圈的大小与葡萄糖氧化酶 的产量成正相关。该方法可以作为葡萄 糖氧化酶产生菌的高通量筛选方法，大 大提高葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种 效率。
表1 经过紫外线诱变所获得的突变菌株的葡萄糖氧化酶活性
菌株号 初筛培养基的 蓝色圈直径 （mm） 6 7 5 9 11 5 葡萄糖氧化酶 酶活是出发 菌株的倍数 1.00 1.21 1.50 0.83 2.50 0.73
（/g）
11.5 13.9 17.3 9.5 28.7 8.4
P-9 U-15 U-17 U-56 U-69
• 1999 年,黄道震等以葡萄糖含量为30 %的 发酵培养基接种10 %的黑曲霉种子液,通气、 220 r 〃min - 1，搅拌、流加氢氧化钠溶液 控制p H 值6.0～6.5 、温度32～ 34 ℃、 发酵20 h , 残糖可降至1 g 〃L - 1 以下。 • 2002 年,Anastassiadis 等利用筛选得到 的短梗霉( Aureobasi di um p ul l ul ans) 在连续式搅拌发酵罐中进行了静息细 胞和固定化细胞的葡萄糖酸连续转化实验, 葡萄糖酸浓度可达260 g 〃L - 1 ,最高生 成速率为19 g〃L - 1.h - 1 。
发酵过程影响葡萄糖酸产量的因素
葡萄糖浓度 发酵液PH值 溶氧 接种量
• 葡萄糖酸浓度的测定
发酵过程中葡萄糖酸的生成会导致发酵液 p H 值下降,利用NaOH 与葡萄糖酸中来维 持发酵p H 值时,生成葡萄糖酸的钠盐,其 葡萄糖酸根可与Cu2 + 、Fe3 + 等金属离 子发生络合反应,加热后呈现一定的色,660 nm 波长下可测定其吸收值,由标准曲线方 程推算可知葡萄糖酸的浓度。
表3 10 L 发酵罐中pH值控制方式对发酵产 葡萄糖酸的影响
p H 值控制方式 pH值 发酵时间/ h 残糖浓度/ g ·L - 1 葡萄糖酸浓度/ g ·L -1 葡萄糖平均消耗速率/ g ·L - 1 ·h - 1 葡萄糖酸平均生成速率/ g ·L - 1 ·h -1 转化率/ % 流加NaOH 5.6 43 9 170 4.06 4.05 81.8 流加Ca (OH)2 乳浊液 5.6 56 6.8 156 3.16 2.40 74.2
pH值的控制方式
黑曲霉在葡萄糖酸的生成过程中p H 值 会不断下降,若降至415 以下会导致柠檬 酸的生成,为此需对发酵过程中p H 值进 行控制,一般可通过添加碳酸盐、金属氧 化物和碱来实行。在10 L 发酵罐(装液 量615 L ,葡萄糖含量20 %) 中分别采用 NaO H、Ca (OH) 2 、CaCO3 来控制p H 值,考察了不同控制方式对黑曲霉 发酵产酸的影响,结果见表3 。
•
EDTA 定钙法，发酵过程中葡萄糖酸的生成导 致发酵液p H 值下降,利用Ca (O H) 2 及CaCO3 与葡萄糖酸中和来维持发酵p H 值时,生成葡萄糖 酸的钙盐,通过直接测定发酵液中钙离子的含量可 折算得到生成的葡萄糖酸浓度(W G) 。
×M W G = ——-———— V S 式中: cE 为所用EDTA 的浓度,mol 〃L - 1 ;M 为葡萄糖酸的摩尔质量,196 g 〃mol - 1 ;V E 为所用EDTA 的体积,mL ;V S 为所取用的待标定 溶液的体积,mL 。
添加CaC
5.0～5 67 10 152
2.84
2.27
73.5
由表2 可见,发酵过程中流加NaOH 控制p H值,各项指标都达最高,发酵时间最短; 流加Ca (OH) 2乳浊液和添加CaCO3 控制 p H 值的指标接近,但比流加NaOH 要低 很多。当临近终点时,发酵液出现大量白 色的葡萄糖酸钙结晶颗粒,使得发酵产物 的浓度受到限制,无法得到高浓度葡萄糖 酸。
表2 葡萄糖含量对摇瓶发酵产酸的影响
葡萄糖含量/ % 葡萄糖酸浓度/ g 〃L - 1 残糖浓度/ g 〃L - 1 转化率/ % 葡萄糖平均消耗 速率/ g 〃L 1 〃h - 1 10 62.6 2.87 80.0 2.38 20 119.1 6.49 80.1 4.5 30 107.8 14.74 64.9 5.09
葡萄糖酸发酵的生物工艺
• 黑曲霉发酵能力的特性不仅由其遗传 特性决定，其所处的环境条件也决定 了发酵法生产葡萄糖酸的产量，发酵 法生产葡萄糖酸产量的高低除了受生 产菌种的影响外，培养基的组成和培 养条件对产量的影响也很大。黑曲霉 发酵水平的提高，主要依赖于菌种选 育及发酵工艺(培养基和培养条件)的优 化，这两个环节是相辅相成的。
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葡萄糖酸的发现
• 1880年Boutroux发现使用 醋化醋杆菌发酵葡萄糖能 够产生一种不挥发的酸， 后来确定为葡萄糖酸。 以后的许多研究者报道了 其他几种细菌也能够产生 葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸。 上个世纪30年代以前，生 产葡萄糖酸主要是使用细 菌。1922年，Molliard发 现，利用霉菌也能够发酵 葡萄糖酸，后来人们知道 黑曲霉、米曲霉、文民曲 霉和青霉都有氧化葡萄糖 产生葡萄糖酸的能力。
U-78
葡萄糖酸发酵生产
一 材料和仪器
1 菌种 黑曲霉 （U-69 菌株） 2 培养基 (1) 查氏培养基( g 〃L - 1 ) : 蔗糖30 ,NaNO3 4 g, MgSO4 〃7H2O 0.5g,KCl 0.5g ; FeSO4 0.1 g,K2 HPO4 1 g, 琼脂20 g,p H 值5.5 ,温度31 ℃。 (2) 种子培养基(g 〃L - 1 ) :葡萄糖(水解糖) 40 ,麸 皮32 , ( N H4 ) 2 HPO4 0.4 g, KH2 PO4 0.2 g, MgSO4 〃 7H2O 0.2g ,CaCO3 10 g,p H 值5.6 。 (3) 发酵培养基(g 〃L - 1 ) :葡萄糖(水解糖) 100～ 300 , ( N H4 ) 2 HPO4 014 , KH2 PO4 012 , MgSO4 〃7H2O 0.15 g,CaCO3 27～81 ,p H 值5.6 。