普通生物学实验(动物、植物)实验一(1)普通光学显微镜及其使用一、实验目的了解普通光学显微镜的构造及其原理,并熟练掌握其操作方法。
二、实验用品普通复式光学显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、擦镜纸。
三、实验原理和方法普通光学显微镜从构造上可分光学、机械和电子三大系统。
1、显微镜的光学系统光学系统通常由物镜、目镜、聚光器和光阑组成。
1)、物镜(objective)显微镜的质量主要取决于物镜。
物镜种类繁多,性能相差悬殊。
物镜的放大倍数用数字表示,如4、10、20、40和100等。
a.干燥系(drysystem)物镜镜检时,物镜与盖片间,不添加任何液体。
如4×、10×、20×和40×物镜都属干燥系,使用时不加用任何浸液,只以空气为介质,其折射率为1,所以干燥系物镜的数值孔径小,分辨率亦低。
b.浸没系(immersionsystem)物镜物镜在使用时,前透镜与盖片之间浸满液体。
依充添的浸液的不同,主要可分为油浸系(oil immersion)和水浸系(water immersion)等类别。
最常用的浸没液为香柏油(cederoil),其折射率为1.515,与玻片的折射率相近,且不易干涸。
使用水浸物镜时加用水,其折射率1.33。
油浸物镜外壳上刻有:“oil”、“oel”、“imm”和“HI”等字样,水浸物镜刻有“W”或“Water”字样;油、水浸两用物镜则刻上“oil+w”字样;甘油浸没物镜刻有“Glyc”或“Glyz”等字样。
2)、目镜(eyepiece,ocular)目镜作为影像和肉眼间的放大镜,将物镜映来的影像做第二次放大。
同时,目镜作为物镜的补偿,把物镜残留下的像差给予进一步校正,以提高造像质量。
目镜作为投影器,把放大的影像投射在摄影暗箱的焦平面上。
目镜通常由两片(组)正透镜组成,上面的透镜叫接目或眼透镜(eye—lens),它决定倍数和成像的优劣;下面的透镜叫会聚透镜(collectivelens)或场镜(fieldpiece),它使视野边缘的成像光线向内折射,进入眼透镜中,使物体的影像均匀明亮。
上下透镜的中点,或场镜下面设有用金属制造的光阑叫做视野光阑或场光阑(field stop)。
场镜或物镜在这个光阑面造像,在光阑上可装入各种目镜测微计、十字线玻片和指针等。
由眼透镜射出的成像光线基本上为平行光束,并在目镜之上约10mm处交叉,此交叉点称作出射光瞳。
3)聚光器(condensers)聚光器等聚光系统,使来自光源的光线放大,并聚成光束,透过载片照明样品,射入物镜。
聚光器由聚光镜和孔径光阑(aperture diaphragm)构成。
聚光镜属正透镜系统,由一至数片透镜组成,具会聚作用,把照明光线会聚放大,射向被检样品,进入物镜。
孔径光阑位于聚光镜下方,光阑的孔径可变,以改变照明光束的直径,调节进光量。
孔径光阑的开度,即聚光器数值孔径,左右显微镜的成像质量。
物镜的有效数值孔径,其中涵容聚光器的数值孔径,即:物镜的有效数值孔径=物镜数值孔径+聚光器数值孔径/。
2、显微镜的照明普通光学显微镜,普遍采用中心亮视野透射照明法。
照明光源:照明光源以钨丝灯和卤钨灯为多。
卤钨灯优于钨丝灯,为显微镜的主要光源。
3、光路及成像显微镜的光路或光程(1ight path)即光源照明的通路。
光路始于光源灯,光源装在镜座后方的灯室(1amp housing)内。
光源灯丝(S)发出的色光,由聚光透镜集光成束或光锥,经镜座中的视场光阑(L),投向反光镜,呈现45°折射向上,入射孔径光阑,光源灯丝在此平面处第一次成像(S1)。
透过聚光镜使光线放大、聚集,透射、照明载物台的样品,视场光阑在此平面处第一次成像(L1),即在样品聚焦的同时,可见清晰的、缩小的视场光阑的影像。
成像光束继而进入物镜,在物镜的后焦面(rearfocal plane)的平面处,光源灯丝第二次成像(S2)。
成像光束经转折进入目镜,在目镜的场光阑平面处,视场光阑第二次成像(L2)。
最终,成像光束从目镜眼透镜射出,在目镜的出射光瞳处,光源灯丝第三次成像(S3)。
视场光阑的第三次成像(L3)在人眼的视网膜上。
在成像系统中,一个位置的改变,会引起整个成像关系的改变,光源灯前后位置的稍许位移将导致光源成像位置的变动。
4、放大率(magnification)显微镜最后形成的物体放大影像,对被检物体的大小比例称为放大率,即像高比物高。
放大倍数以长度计算,而不是以面积或体积计算。
某些显微镜为适应不同需要,镜筒内装有倍数不同的附加透镜系统。
在专用的显微摄影装置中,附有摄影透镜(photographic lens)。
显微摄影总放大率的计算,除目镜、物镜的放大率外,摄影透镜的放大率亦要计算在内。
显微镜的总放大率(Mt)应为;Mt=Mob×Me×MphMob:物镜放大率Me:目镜放大率Mph:摄影透镜放大率5、显微镜的使用正确、合理地使用显微镜,是做好镜检和显微摄影的前提。
1)光路合轴调整照明光束应与显微镜的光轴合一,使光源均匀地照明视场。
镜检和摄影前,光路要合轴调整,使照明光束与显微镜的光轴于同一轴线上。
光路系统中的目镜、物镜和视场光阑位置固定,勿需调整,仅聚光器可调。
因此,光路的合轴实为聚光器和光源灯的调中。
a.聚光器的调中聚光器的调中步骤如下:(1)转动聚光器升降旋钮,把聚光器升至最高位置。
(2)接通光源灯的电源开关。
(3)将制片标本放在载物台上,用4X或低倍物镜对样品聚焦。
(4)缩小视场光阑,在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像。
(5)微降聚光器,至视场光阑的图像清晰聚焦止。
(6)用聚光器两个调中的螺杆推动聚光器,使缩小的视场光阑的图像,调至视场中心。
(7)开放视场光阑,使多角形的周边与视场边缘相接。
(8)反复缩放视场光阑,确认光阑中心和边缘与视场完全重合。
(9)使聚光器回复顶点位置。
在视场中,通过观察视场光阑影像的相对移动,使聚光器调中,达到光轴合一。
2)光阑及其使用显微镜有两种光阑:视场光阑和孔径光阑。
视场光阑控制照明光束,限定视场大小。
孔径光阑通过光阑的放缩,限定,聚光镜的孔径大小。
两者皆为可变光阑(irisdiaphragm),正确调节和使用光阑,是保证镜检和摄影质量的重要环节。
四、思考题1.物镜的种类各具何种特点?2.目镜在显微镜的成像上起何作用?3.聚光器的构成及其作用?4.如何进行光路合轴调节?5.物镜和目镜的选用及其组合的原则?实验一(2)细胞的形态与结构一、实验目的和要求1、学习并掌握显微镜的正确使用方法。
2、了解真核细胞的各种形态和基本结构。
3、学习临时装片标本的制作方法。
4、了解植物细胞中贮藏的内含物种类及其特性。
二、实验原理细胞是构成植物体的基本单位,也是植物生命活动的基本单位。
根据细胞的结构和生命活动的方式,可以把构成生物有机体的细胞分为两类,即原核细胞和真核细胞。
原核细胞内没有典型的细胞核,也没有分化出以膜为基础的具有特定结构和功能的细胞器;而真核细胞的DNA主要集中在由核膜包被的细胞核中,并分化出多种以膜为基础的细胞器。
高等植物核绝大多数低等植物均由真核细胞构成。
植物细胞通常很小,其直径一般在20~50μm之间,因而要借助显微镜才能观察到。
但也有少数植物细胞,如苎麻(Boehmeria nivea)的纤维细胞长可达550mm,用肉眼即可看到。
尽管不同植物细胞在形态、大小上有一定差异,但它们的基本结构是一致的。
三、实验材料和用品实验材料:1、洋葱鲜鳞茎。
2、新鲜菠菜。
3、马铃薯块茎。
4、新鲜花生米或菜豆种子。
实验器材:显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、吸管、尖头镊子、刀片等实验试剂:1、碘-碘化钾溶液:取3g碘化钾溶于100ml蒸馏水中,再加入1g碘,溶解后即可使用。
此液应放在棕色试剂瓶中,暗处保存。
2、苏丹III染液:、先将0.1g苏丹Ⅲ或Ⅳ溶解在50ml丙酮中,再加入70%酒精50ml。
四、实验内容1、以洋葱鳞茎的表皮为材料,在光镜下观察植物细胞的基本组成和结构。
2、菠菜叶肉细胞中叶绿体的观察。
3、蚕豆表皮细胞气孔的观察。
4、运用特异性染色方法鉴定植物细胞中主要的内含物。
五、实验方法和步骤1、物细胞结构的观察1)洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片标本的制作与观察a.取一洗净的载玻片,用纱布擦干,于玻片中央滴一滴蒸馏水,用尖头镊子从洋葱肉质鳞片叶内表皮撕下一小块表皮,铺在水滴上,用解剖针轻轻将其压入水中,使之展平。
b.用镊子夹住洗净擦干的盖玻片的一边,使另一边接触水滴的边缘,然后慢慢地放下,以便驱走盖玻片下的空气,不致产生气泡。
c.用吸水纸吸去盖玻片周围的水,于显微镜下观察。
d.在低倍下,可见洋葱表皮细胞略呈长方形,排列紧密,每个细胞内有一圆形或扁圆形的细胞核。
e.在盖玻片的一侧滴上一滴碘-碘化钾溶液,滴在盖玻片边缘的载玻片上,然后用吸水纸一侧将盖玻片下的水分吸去,把染料引入盖玻片与载玻片之间,对材料进行染色观察。
注意:1.撕表皮时不要把表皮撕得过大,如撕下的表皮面积大于盖玻片,要将表皮放在有水的载玻片上,用刀片切成小块,便于观察。
2.撕表皮时动作要迅速,勿将撕下的表皮在空气中暴露时间过久,以免使生活细胞由于失水而受到损伤。
3.撕开的一面最好朝上放在载玻片上,以利于染色和进行组织化学实验的观察。
4.撕下的表皮一定要平铺在有水的载玻片上,如发生褶皱或重叠要用解剖针将其铺平,以免影响观察效果。
2).菠菜叶肉细胞叶绿体的观察取一新鲜菠菜叶片,用镊子撕去一小块下表皮,用小刀轻轻刮取一点叶肉细胞,制作菠菜叶肉细胞临时装片标本。
将所制标本先置低倍镜下观察,然后再转高倍镜,注意叶肉细胞内叶绿体的形态、数目。
3).气孔的观察取新鲜蚕豆叶片,用刀片在叶的背面轻轻划一个小方块,用镊子从切口处夹住表皮,并向切开的方向撕下表皮,放在载玻片上的水滴中,用镊子展平,盖上盖玻片,在显微镜下观察,先在低倍镜下找出比较薄的部位,然后换至高倍镜下观察。
注意观察气孔的形态及类型。
4). 植物细胞的内含物在细胞代谢活动中,常常有一些代谢产物以不同形式贮存在液泡、细胞质或细胞器中,其中有些物质,如淀粉、脂肪、蛋白质等可以通过特殊的显色方法显示出来。
取马铃薯(Solanum tuberosum)块茎切成两半,用解剖刀在切开的块茎表面轻轻刮一下,将附着在刀口附近的浑浊汁液放在载玻片上,用碘-碘化钾染色,然后盖上盖玻片,在显微镜下观察。
取一粒菜豆(Phaweolus vulgaris)种子,剥去种皮,用刀片对含有丰富贮藏物质的肥厚子叶做徒手切片,选取较薄的切片放在载玻片上,用碘-碘化钾染色,盖上盖玻片后在显微镜下观察。
其中被染成金黄色的颗粒是糊粉粒,这是蛋白质的一种贮藏形式。
取花生(Arachis hypogaea)种子,做徒手切片,选取较薄的切片放在载玻片上,用苏丹III 染色,然后盖上盖玻片在显微镜下观察。