土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选
2013023123刘倩倩
一、实验目的
1. 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。

2. 了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。

根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。

二、实验原理
枯草芽抱杆菌属革兰氏阳性菌，芽抱0.6〜0.9 X 1.0〜1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

有的菌株是a -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中。

选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80 度的水浴处理样品1 小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。

利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3 天后，观察。

然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽抱杆菌。

再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。

三、实验材料
（1）选择培养基
本次实验进行产淀粉酶的枯草芽抱杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。

配方：牛肉膏5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠5.0g
可溶性淀粉10.0g
琼脂20g
蒸馏水1000ml
调整pH 至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

2）溶液或试剂
牛肉膏1.25g
蛋白胨2.5g
氯化钠1.25g
可溶性淀粉2.5g
琼脂5g
碘11 克，碘原液2 毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2 克，磷酸氢二钠45.23 克，柠檬酸8.068 克，氯化钴25 克，重铬酸钾3.34 克，100 毫升0.01NHCL。

（3）仪器或其他用品
平板培养皿10 个、试管15 支、三角瓶2 个、烧杯3 个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。

四、实验步骤
倒平板f制备梯度稀释液f涂布f培养f初筛f复筛f纯化f保存
（1）实验前准备
制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。

倒平板。

把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。

（2）制备土壤稀释液
取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层5cm去
5-15cm处。

用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。

采样后应尽快分离。

振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。

放入盛有99ml 无菌水三角瓶中，常压80 度的水浴处理样品1 小时后，取出。

用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2 、10-3、10-4、10-5 不同稀释度的土壤溶液。

（3）涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3 、10-4、10-5 三管土壤稀释液中各吸取0.2ml ，小
心地滴在对应平板培养基表面中央位置。

用无菌涂布器涂布。

右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。

室温下静置5-10min ，使菌液浸入培养基。

（4）培养
将淀粉培养基平板倒置于30°C 培养箱中培养1—3d。

（5）初筛观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30°C 的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。

（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。

）
（6）复筛
测定其淀粉酶活。

1）试剂和器材
1. 试剂：
①碘原液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。

②稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。

③2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉2 克，加5 毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入70 毫升煮沸的蒸馏水中。

继续煮沸2 分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（PH为6）。

④柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2C45.23克，柠檬酸
（C6H8O7?H2）O8.068 克，加水溶解，稀释至1000毫升。

⑤标准比色液：称取氯化钻（CoCL2?6H2）25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01N HCL，其五倍稀释作标准。

⑥样品：细菌-a淀粉酶
2. 器材
①电热恒温水浴②试管③量筒④吸量管（1ml）
3. 操作方法：
1) 取试管1支，加20毫升2%®粉，混匀，在30C水浴中，使管内温度达到30C。

2) 将淀粉酶0.5ml加到30E的淀粉液中，混匀，在30C水浴中保温，自加入记时，经5 分钟后取反应液1 毫升，加入盛有5 毫升稀碘液的试管中。

混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间。

3) 计算。

在上述条件下，每一小时催化1 毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一个酶活力单位。

(7) 纯化并保存
菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。

同时，做好以下工作：
①做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等。

②防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在2—3 只试管中备用。

③原始菌种妥善保存。

五、结果与分析
1. 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数
2. 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果。