3,5－二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖3,5－二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖【原理】
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。

单糖都是还原糖。

利用单糖、双糖与多糖的溶解度的不同可把他们分开。

用酸水解法使没有还原性的双糖，彻底水解成具有还原性的单糖，再进行测定，就可以求出样品中的还原糖的含量。

在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇（1,2－烯二醇）。

烯二醇易被各种氧化剂如铁氰化物、3,5－二硝基水杨酸和Cu2＋氧化为糖酸。

氰化物和二硝基水杨酸盐的还原作用是还原糖定量测定的基础。

还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。

因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。

【试剂】
1. 小麦粉
2. 6 mol/L HCl
50 ml浓盐酸加水稀释至100 ml。

3. 6 mol/L NaOH
240 g NaOH溶解于500 ml水中加水定容到1000 ml。

4. 碘－碘化钾溶液
20 g碘化钾和10 g碘溶于100 ml水中，使用前取1 ml加水稀释到20 ml。

5. 1 mg/ml的葡萄糖溶液
6. 3,5－二硝基水杨酸
6.3 g 3,5－二硝基水杨酸溶于262 ml 2 mol/L的氢氧化钠溶液中。

将此溶液与500 ml含有182 g酒石酸钾钠的热水混合。

向该溶液中再加入5 g重蒸酚和5 g亚硫酸钠，充分搅拌使之溶解，待溶液冷却后，用水稀释到1 000 ml。

储存于棕色瓶中（需在冰箱中放置一周后方可使用）。

【操作】
1. 葡萄糖标准曲线的绘制
取试管6支，按下表操作：
管号 1 2 3 4 5 6
1 mg/ml葡萄糖溶液（ml）蒸馏水（ml）3,5－二硝基水杨酸（ml） 0 0.1 0.
2 0.
3 0.
4 0.5
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分混匀后于沸水浴中加热煮沸5 min。

冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4 ml，混匀。

以管1为空白对照，540 nm波长下测各管的OD值。

绘制光密度－葡萄糖浓度曲线。

2. 还原糖的制备
称取小麦粉2 g，置于100 ml小烧杯中，加入50～60 ml蒸馏水，搅拌均匀。

50℃保温30 min。

将烧杯内含物转入100 ml容量瓶，加水到刻度。

混匀后过滤。

滤液用于测定还原糖。

3. 样品的酸水解和总糖提取
称取小麦粉1 g，置于100 ml小烧杯中并溶于15 ml蒸馏水。

加入10 ml 6 mol/L的盐酸，混匀后沸水浴煮沸30 min，冷却。

加入6 mol/L的氢氧化钠中和。

溶液转入100 ml
容量瓶，加水到刻度并混匀。

过滤后取1 ml 滤液加水至10 ml。

4. 样品总糖和还原糖的测定
取试管3支，按下表操作：
管号 1 2 3
还原糖抽提液（ml）总糖抽提液（ml）3,5－二硝基水杨酸（ml） 000.5 0.500.5 00.50.5
沸水浴中加热5 min，然后冷却
蒸馏水（ml） 4.5 4 4
管1为对照，测定各管在540 nm下的OD值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计算还原糖和总糖的百分含量，即：
式中 N ——稀释倍数
V ——溶液的体积。