PCR法支原体测定PROTOCOL
生效日期（年-月-日）
有效期至（年-月-日）
分发部门：质量部
1.目的
规范PCR法支原体检测的操作方法。
2.范围
适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。
3.责任
质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。
4.定义
N/A
5.设备、材料和试剂
5.1设备、材料
设备名生产商型号/货号备注PCR仪Thermo ARKTIK5020 N/A VORTEX IKA GENIUS 3 N/A
小型台式冷冻离心
机Thermo
HERAEUS Fresco
21
N/A
单道移液器
(10ul,20ul,100ul)
Eppendorf Research plus N/A 多功能水平电泳槽Tanon HE-120 N/A
凝胶成像系统BIORAD ChemiDoc™
XRS+ System
N/A
5.2试剂
试剂名称生产商货号TaKaRa PCR Mycoplasma
Detection Set
TaKaRa 6601 TaKaRa Ex Taq® TaKaRa RR001A Regular Agarose G-10 Biowest N/A Goldview 国产N/A
10×Loading Buffer TaKaRa 9157
DL5000 DNA Marker TaKaRa 3428A
内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司
6.溶液配制
6.1 50× TAE Buffer
称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml 超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。
有效期6个月。
6.2 1× TAE Buffer
量取10ml 50× TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。
有效期6个月。
7.操作步骤
用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。
如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。
如果样品中含有PCR 反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。
7.1 1st PCR反应
7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系）
试剂用量（ul）
内毒素检查用水37.75~38.75
10× PCR Buffer 5
dNTP Mixture 4
MCGp F1 Primer 0.5
MCGp R1 Primer 0.5
TaKaRa Taq 0.25
7.1.2向以上反应混合液中分别加入1ul阴性对照样品（内毒素检查用水），1ul供试品，1ul阳性对照样品(Control Template)和2ul供试品阳性对照（1ul供试品+1ulControl Template)，添加样品时务必防止交叉污染。
为了避免交叉污染，实验过程需分区域操作。
在实验区域1完成PCR反应液配置后，先在该实验区域加入1ul内毒素检查用水（阴性对照），再在实验区域2加入1ul供试品，最后在实验区域3加入1ul Control Template（阳性对照）及“1ul供试品+1ul control Template”（供试品阳性对照）。
7.1.3将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。
94℃30sec
94℃ 30sec
55℃ 2min 35 cycles
72℃ 1min
72℃ 5min
7.2 2nd PCR反应
7.2.1按下表顺序配制反应混合液
试剂用量(ul)
内毒素检查用水39.25
10× PCR Buffer 5
dNTP Mixture 4
MCGp F2 Primer 0.5
MCGp R2 Primer 0.5
TaKaRa Taq 0.25
7.2.2用内毒素检查用水将1st PCR反应产物稀释100倍，取0.5ul加入以上反应混合液中。
为了防止交叉污染，加样时需分区域操作，具体加样方式同7.1.2。
7.2.3 将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。
94℃30sec
94℃ 30sec
55℃ 2min 30 cycles
72℃ 1min
72℃ 5min
7.3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析
7.3.1 1%琼脂糖凝胶的制备
称取0.4g Regular Agarose G-10，加入约40ml 1× TAE Buffer（大于40ml），置于微波炉中中高火加热2min，摇匀，再加热2min。
稍微冷却后加入1ul Goldview，振荡摇匀，倒入胶槽中，冷却30min左右直至凝固。
取出制备完成的琼脂糖凝胶置于多功能水平电泳槽中，加入1×TAE Buffer 直至超过凝胶2mm左右。
7.3.2 上样
取1st和2nd PCR产物各10ul，加入1.1ul 10×Loading Buffer，混匀后，取10ul上样，用6ul DL5000 DNA Marker作为对照。
7.3.3 电泳及分析
调节电压120V，电泳1h。
取出凝胶置于凝胶成像系统，拍照并分析确认扩增片段的有无及片段大小。
8.数据分析
8.1 Control实验（阴性对照，阳性对照，供试品阳性对照）
本实验中以内毒素检查用水作为阴性对照样品；以Control Template作为阳性对照样品；以“供试品+Cont rol Template”作为供试品阳性对照样品。
使用Control Template时，F1和R1引物扩增产物是810 bp（见图1，泳道5、6），F2和R2引物扩增产物是590 bp（见图1，泳道11、12）。
当阴性对照结果呈阴性，阳性对照结果呈阳性，此反应系统可行。
当供试品阳性对照结果呈阳性，说明待测样品对PCR反应无阻碍；如果供试品阳性对照结果呈阴性，说明检测样品中有阻碍物，建议将检测样品进行DNA 提取，再以其作为模板进行扩增。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
图1 1、DL5000 Marker；2、H2O-1(1st)；3、H2O-2 (1st)；4、待测样品；5、待测样品+control(1st)；
6、control(1st)；
7、H2O-3 (1st)；
8、H2O-1(2nd)；
9、H2O-2 (2nd)；10、待测样品(2nd)；11、
待测样品+control(2nd)；12、control(2nd)；13、H2O-3 (2nd)
8.2 供试品检测
若待测样品检测结呈阴性，说明无支原体污染，若待测样品有条带，则进一步确认片段大小。
表1是以12种Mycoplasma DNA分别作为模板，2对引物进行扩增所得到的片段大小。
图2是12种Mycoplasma DNA，取1ng进行两轮PCR 反应（反应体积为100ul）后的电泳结果。
表1 12种Mycoplasma属的扩增片段大小
图2 12种Mycoplasma DNA PCR反应后电泳结果
8.3 问题分析
8.3.1. Control Template是用于检测PCR反应性能的。
当加入Control Template 时，即使检测样品中含有Mycoplasma，也可能没有扩增获得与Mycoplasma相对应的片段，因此不要使用Control Template添加的反应进行样品的结果判定。
为了获得准确的样品检测结果，在做PCR反应时，要保证检测样品是唯一的模板。
8.3.2. 当检测样品中含有大量Mycoplasma时，有时可能只有样品中Mycoplasma的片段扩增，而正对照的Control Template片段却没有扩增。
8.3.3. Control Template是人工合成的，序列中不含Mycoplasma的内部序列。
8.3.4 使用含有10%FCS的DMEM、RPMI培养基，接种后进行3-6天的细胞培养，上清液可以按反应体系的1/10的量直接添加的PCR反应液中，经确认可以扩增mycoplasma DNA。
8.3.5 已确认FCS原液按反应体系1/10的量直接添加到反应液中不会阻碍PCR反应。
9.参考资料
N/A
10.相关文件
N/A 11.附录
N/A。