将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一 份标本；
在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封；
将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。
感病毒对热很敏感 • 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，
采样日期 • 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。
24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下
血清学标本注意事项
• 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清塑料管里， 拧紧；
膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部
的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育
不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
流感病毒操作要求生物安全规程
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本
国家流感中心 张烨
标本种类
临床标本
鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等
血清标本
病人的急性期和恢复期血清双份血清
临床样本的选择
采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例
流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者， 而缺乏其它的实验室确定诊断依据
采集时间：病人发病后的头三天
RT-PCR 组成成分
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94 温 度 72 （℃）
55
22
1
2
3
高温变性低温退火 适温延伸
DNA 2
形
成变 条性 单 链 DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保 存
鉴定方法
血清学方法
红细胞凝集及凝集抑制试验 神经氨酸酶活性及抑制试验
其它方法
核酸检测 快速检测试剂盒
流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结 合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构， 许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。 因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当 血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制 凝集现象出现
临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份（40 ％）用于鸡胚接种，一份（30％）用于MDCK细胞 接种，一份（30％）保存待复核用。对于病毒分离 阳性的标本－70℃保存6个月
鼻咽拭子 或含漱液
快速诊断
病毒分离
样本采集
分型鉴定
双份血清
血凝抑制试验 或中和试验
2020/5/6
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标本接种注意
最好24小时内进行病毒分离
采样液的要求
• 采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素 • 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液，Eagel’s细胞液
采集后应立即放入适当的采样液中低温保存
采样液的抗生素含量
抗生素名称 庆大霉素 抗真菌素
终浓度 0.1mg/ml 2Ug/ml
临床标本的采集法
鼻拭子 咽拭子 鼻咽吸取物 漱口液
病毒分离标本实验室的保存条件
24小时内进行病毒分离，4℃保存 24 ～ 48小时内不能进行病毒分离的－70℃或以下保存
常采用鸡胚和MDCK细胞分离方法
流感病毒分离：生物安全二级实验室 禽流感病毒分离：生物安全三级实验室
正常细胞
病变细胞
细胞分离流感病毒 选择敏感MDCK细胞 细胞70～90％成片 TPCK－胰酶 7.5%BSA
鸡胚分离流感病毒 9日龄SPF鸡胚 尿囊腔和羊膜腔接种： 季节型流感病毒尿囊腔和羊膜腔接种分离病毒 人禽流感病毒尿囊腔分离病毒
不同胰酶TCID50检测结果
MCDK细胞代数 21代 46代
TPCK-胰酶 8.75 9
普通胰酶 3.5 3.5
MDCK细胞敏感性试验结果
MDCK细胞TCID50检测结果
MDCK细胞代数 19代 21代 35代 41代 45代
TCID50 9 9 9.5 9 9
使用TPCT-胰酶, A/北京/西城/156/2006(H3N2) C4
用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
• 使用的试剂可靠无误 • 红细胞悬液浓度是否合适 • 处理后的血清有无残余非特异性凝集素 • 选用标准抗血清是否准确 • 读取HA试验的结果是否正确 • 4个血凝单位是否准确 • 红细胞阴性对照 • 待鉴定病毒确保没有被细菌污染 • 稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确
实验方法 病毒组织培养（病毒分离） 血清学检测 IF 或 EIA
若采集的是鼻咽拭子，同一时间采集的标本可放入同 一管内
注意：采集禽流感疑似病人标本 最好是下呼吸道吸取物
临床样本收集的注意事项
• 操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我保护 • 采集禽流感疑似病人的标本，最好采集下呼吸道吸取物 • 采集标本要有一定力度 • 标本采集后应迅速至于冰上或者4 ℃以下保存，因为流
RT-PCR方法
荧光定量RT-PCR方法
优缺点
肯定 至少约5-7天
可靠 耗时
敏感性波动在40-100%，特 异性在86-99% 敏感特异，检出病毒的最小 量为0.01-0.1 TCID 50
敏感特异，检出病毒的最小 量为0.006-0.02 TCID 50 ， 可定量分析
➢RT-PCR ➢Real-Time PCR ➢NASBA ➢MDD
流感病毒临床标本的运送要求
新鲜的临床采集标本
应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室; 未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存
冻存的临床采集标本
应在冻存的条件下，低温送至实验室
❖含聚丙烯纤维的拭子的采集标本:先将含聚丙烯纤维的拭子在 管壁反复挤压后取出
❖鼻腔或咽部洗液的标本:充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃ 待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或 低温保存