宿主细胞DNA只作为一种细胞污染因素而不作为一种危险因素。 目前均采用DNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检 测试剂盒或者用同位素标记DNA探针进行测定，必须提供相应宿 主细胞DNA标准品。由于设备和消耗试剂昂贵，一定程度限制了 该方法的普及。 由于基因工程药物的生产过程中所使用的各种表达系统中都含有 大量的DNA。因此世界各国的药品管理机构都对基因工程药物中 所允许的DNA残余量严加限定。WHO和FDA将此限量定在100pg ／剂量。参照药典三部附录IX B外源性DNA残留量测定法每1次人 用剂量应不高于10ng。
文件编号： T09-SS10 生效日期： 年 版本号：01
月
日
重组蛋白药物一般生产工艺与质 量控制要点
起草人/日期： . 审核人/日期： .
批准人/日期：
.
1
培训目的及范围
培训目的 1、熟悉生物制品一般生产工艺及质量控制要点。 2、了解检验项目设置缘由及控制标准。 培训范围 1、QC部 2、QA部
11 12
24
重组蛋白药物质控要点

原液：生物学活性检测

生物学活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段。参 照中国药典标准中的规定及注册质量研究资料，采用脱E受体法或 MTT比色法检出本品，专属性强、方法可靠。
25
重组蛋白药物质控要点

原液：蛋白含量检测

在质量标准中设定此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的 控制。目前实际应用最多的是(Lowry)法，也称之为福林一酚试剂 法，其灵敏度比双缩脲法高约100倍，比紫外吸收法高约10～2O 倍，是蛋白质量化的较可靠方法，具体操作可按照《中国药典》 2010年版三部(附录Ⅵ第二法)的规定。参照中国药典三部的标准 的规定及本品质量研究资料，此方法能够检出本品，专属性强、 方法可靠，能够控制本品含量。如不适用此类方法则采用液相法 。
2
基本知识
蛋白质的基本性质
1、蛋白质大小（一般5-10nm） 2、蛋白质形状 3、蛋白质核电性 4、蛋白质等电点（一般4.0-10.0） 5、蛋白质疏水性 6、蛋白质溶解度 7、蛋白质密度（一般1.3-1.4g/cm3） 8、蛋白质与配体结合能力（酶，抗体） 9、蛋白质与金属螯合能力（CU2+、ZN2+、CA2+、NI2+） 10、蛋白质其它特殊性质(抗热性、抗蛋白酶)
5
重组蛋白药物一般生产工艺

第一步：工程菌构
6
重组蛋白药物一般生产工艺

目标产物鉴定

基因序列测定 表达产物结构确证 特异性鉴别实验 N末端氨基酸序列分析 氨基酸组成分析 C末端氨基酸序列分析 激光解析飞行时间质谱分析 X射线晶体衍射分析
7
重组蛋白药物一般生产工艺

35
重组蛋白药物质控要点

原液：圆二色谱分析


对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象，这种吸收程度的不同 与波长的关系称圆二色谱，是测定分子不对称结构的光谱法。 用于测定蛋白质的立体结构，核酸和多糖的立体结构。 在蛋白质分子中，肽链可形成α-螺旋、β-折叠、β-转角等特定的 立体结构。这些立体结构都是不对称的。
22
重组蛋白药物质控要点

发酵液：一般检测项目
现质量标准 中间体名称 检测项目 表达量 质粒丢失率检查 合格标准 ≥25% 符合规定
发酵菌体
23
重组蛋白药物质控要点

原液：一般检测项目
1 3 5 7 9 生物学活性（有效项目） 比活测定（有效项目） 分子量（鉴别项目） 肽图（鉴别项目） N-末端氨基酸序列测定（鉴别项目） 宿主菌蛋白残留量（安全项目） 细菌内毒素（安全项目） 2 4 6 8 10 12 蛋白含量（有效项目） 纯度测定（有效项目） 紫外吸收光谱（鉴别项目） 等电点（鉴别项目） 外源性DNA含量（安全项目） 圆二色谱分析（鉴别项目）
36
重组蛋白药物质控要点

原液：圆二色谱检测

蛋白质的肽键在紫外185～240纳米处有光吸收，因此它在这一波 长范围内有圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆 值波长的变化曲线──圆二色谱是不同的。α-螺旋的谱是双负峰形 的，β-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰。 蛋白质的圆二色谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的代 数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中各 种立体结构的含量。蛋白质含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它们在 240～350纳米处有光吸收,当它们处于分子不对称环境中时也表现 出圆二色性。这一范围的圆二色性反映出在蛋白质分子中上述氨 基酸残基环境的性质。
34
重组蛋白药物质控要点

原液：宿主菌蛋白残留量检测


如在临床使用中需要反复多次注射的药品，则需要做残余菌体蛋 白含量测定，所用方法以双抗体夹心ELISA为宜，尽量不用点免疫 。因为用点免疫测菌体蛋白含量，实验结果不客观，主要是因为 检品和菌体蛋白标准难以在同等条件下进行直接点膜，当检品浓 度较高时，在硝酸纤维膜上形成一定厚度的样品模块，影响了菌 体蛋白与膜的结合，导致测定结果偏低。 不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同，如来自大肠杆菌的产品 为不大于0．1％ ；来自CHO细胞表达产品为不大于0．05％。本 检品中宿主蛋白含量应不高于总蛋白的0.1%。
26
重组蛋白药物质控要点

原液：比活测定检测

比活性是指单位重量蛋白的活性，反应单位蛋白活性的高低。是 活性生物制品的重要指标和检测依据。
27
重组蛋白药物质控要点

原液：纯度检测 根据《人用重组DNA产品质量控制技术指导原则》有关要求，应 用至少两种不同原理的方法进行纯度分析，且纯度均不得低于 95.0％，才能判为合格。因胸腺肽a1与白介素-2（125Ser）在临 床上使用剂量在毫克级，故纯度要求应较严格。
32
重组蛋白药物质控要点

原液： N-末端氨基酸序列测定

可以确证表达产物的编码准确性。对蛋白质的全氨基酸序列分析 ，难度大，耗时长，从统计学观点只要测定N-末端15个氨基酸便 可保证其顺序的正确性。故N-末端15个氨基酸序列分析可作为重 组蛋白质的重要鉴别指标。
33
重组蛋白药物质控要点

原液：外源性DNA含量检测
重组蛋白药物一般生产工艺

第三步：目标蛋白分离与破碎
11
重组蛋白药物一般生产工艺

第三步：目标蛋 白纯化
12
重组蛋白药物一般生产工艺

第三步：目标蛋白纯化（反相与超滤）
13
重组蛋白药物一般生产工艺

蛋白纯化方法
分离方法 沉淀法 硫酸铵 丙酮 聚乙烯亚胺 等电点 双水相法 电泳法 凝胶电泳 等点聚焦电泳 离心法 超律法 电荷、大小、形状 等电点 大小、形状、密度 大小、形状 溶解度 溶解度 电荷、大小 溶解度、等电点 溶解度 蛋白质性质基础 分离方法 层析法 离心交换层析 疏水作用层析 反相层析 亲和层析 外源凝集素亲和 层析 金属亲和层析 免疫亲和层析 层析聚焦 凝胶过滤层析 电荷及分布 疏水性 疏水性、大小 配体结合 糖基内容与种类 金属螯合能力 特异抗原位点 等电点 大小、形状 蛋白质性质基础
30
重组蛋白药物质控要点

原液：肽图检测


肽图分析是DNA产品质控的重要手段之一。通过肽图分析，可从 一级结构研究重组产品与天然品的同质性。重组产品与天然产品 具有相同的指纹图谱，它们具有相同的一级结构。进一步验证了 它们的同质性。 大多基因工程产品都将肽图分析作为控制其一致性的重要常规指 标之一，而采用的方法中．又以HPLC肽图分析最为多见。肽图谱 对每一种蛋白质来说是特征和专一的。因此可用于检查各批产品 蛋白质一级结构的一致性在肤图分析中的应用基因重组药物的肽 图分析是评价基因重组制品和天然蛋白质的同一性以及不同批制 品间同一性的重要手段，也是证明细胞遗传稳定性的有效手段之 一。
31
重组蛋白药物质控要点

原液：等电点检测

不同蛋白质由于某些带电氨基酸带负电荷的Glu，Asp和带正电荷 的Lys，Arg,His等的存在，其净电荷各不相同，即等电点各不相同 。均一的蛋白质只有一个等电点，有时因加工修饰等影响可出现 多个等电点，但应有一定的范围。所以等电点测定是控制重组产 品生产工艺稳定性的重要指标。
3
培训内容
第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺 第二部分：重组蛋白药物质控要点 第三部分： 注射用重组人胸腺肽α1与注射用重组白 介素-2（125SER）生产工艺 第四部分：注射用重组人胸腺肽α1与注射用重组人白 介素-2(125SER)质量控制标准
4
第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺
第一步：工程菌构建 第二步：菌体发酵与诱导表达 第三步：目标蛋白提取与纯化 第四步：配液与冻干
29
重组蛋白药物质控要点

原液：紫外光谱扫描检测

这是基因工程药物的一个重要物理常数，对于一个蛋白质来说， 它的最大吸收波长是固定的。对某一重组蛋白质来说，其最大吸 收波长是固定的；在生产过程中每批产品的紫外吸收光谱应当是 一致的。测定时以生理盐水为对照，在200～350 nm范围内对待 检样品溶液进行扫描，每批制品紫外吸收图谱应与对照品一致且 在280nm附近最大吸收波长应与理论值相符。


高效液相法——本检测采用protein C18反相色谱柱，可精确地测 定产品的纯度，及对空间构相作初步分析。一般尽量采用与SDS— PAGE法原理不同的RP—HPLC或其它离子交换HPLC法进行分析， 而不采用SEC—HPLC进行分析。 电泳法——用SDS—PAGE法分析，可将不同分子量的蛋白质分开 ，从而测定蛋白质的纯度，通过凝胶扫描仪扫描进行纯度分析。 样品在凝胶电泳上显现出条区带，说明样品在该电泳条件分子量 是一致的，为分析是否存在相同分子量的杂蛋白，还应选择另一 种方法进行纯度分析。