吉林化工学院生物工程专业四类微生物的分离、培养及鉴定摘要：学习和掌握细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法，学习和掌握细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法。
通过观察和比较分离出来的细菌以及放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，掌握初步鉴别上述微生物的方法。
本实验通过从土壤中分离细菌、放线菌、霉菌[1]以及在面曲中提取酵母菌四类微生物，在各自的培养基分别培养最后在显微镜下观察、鉴定。
得出这四类微生物菌落特征不同。
关键字：微生物、分离、培养、鉴定前言：微生物发酵工业中，要使微生物良好地生长或累积代谢产物，就需要应用微生物纯种培养技术。
微生物纯种培养技术的发展表现为：从固体培养法为主发展到液体培养法为主；从浅层培养法为主发展到深层发酵法；从静止培养法发展到通气搅拌培养法；从单罐培养发展到连续培养以及多级连续培养；从利用分散的微生物细胞发展到固定化细胞；从利用自然菌种到利用变异菌株以至“工程菌”等等。
分离技术是人类揭开微生物世界奥秘的重要手段，要知晓在自然条件下处于混生状态的某一种微生物的特点以及它对人类是有益或是有害之谜，就必须采用在无菌技术基础上的纯种分离方法。
利用固体培养基来分离和纯化微生物。
显微镜来鉴别微生物。
1.实验仪器与试剂1.1主要仪器显微镜、天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH 试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等1.2主要试剂牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4•7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。
2.实验步骤2.1培养基的配制2.1.1肉膏蛋白胨培养基的配制培养基成分牛肉膏0. 45g蛋白胨 1.5gNaCl 0.75g琼脂 2.25g水150mLpH 7.2~7.4配制方法（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。
然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。
（5）分装、加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
2.1.2高氏一号培养基的配制培养基成分可溶性淀粉3gKNO3 0.15gNaCl 0.075gK2HPO4 0.075gMgSO4 0.075gFeSO4 0.0015g琼脂3g水150mLpH 7.2～7.4配制方法（1）称量及溶化：先称量可溶性淀粉，置于一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，加热，使淀粉完全融化。
再分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/lLNaOH溶液调pH至7.2~7.4。
（5）分装、加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
2.1.3马丁氏培养基的配制培养基成分葡萄糖 1.5g蛋白胨0.75gK2HPO4 0.15gMgSO4•7H2O0.075g琼脂 2.4g水150mL链霉素溶液（10000U/ml）0.49mL（临用前加入）的配制方法（1）称量：称取培养基各成分的所需量。
（2）溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加入并溶化培养基各成分。
（3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（4）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
（5）加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
（7）临用前，加热融化培养基，待冷却至60℃左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。
2.1.4豆芽汁葡萄糖培养基的配制培养基成分黄豆芽15g葡萄糖7.5g水150mL配制方法（1）称取新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100mL水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。
（2）按100ml 10％豆芽汁加入5g葡萄糖。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
（4）分装、加塞、包扎。
（5）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
2.2微生物的分离和培养2.2.1细菌分离（1）制备土壤稀释液称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。
然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10－3 (10)－7顺序编号，放置在试管架上。
取移液管一支，准确吸取0.5ml10－2土壤稀释液，此为10－3稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成10－4、10－5、10－6、10－7的土壤稀释液。
（2）．涂布分离用无菌移液管分别吸取上述10－7、10－6、10－5、三个稀释度菌悬液0.1ml，依次加入对应编号已经准备好的平板上。
右手持无菌玻璃涂棒，左手那培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。
每个稀释度涂两个平板。
（3）．恒温培养将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。
2.2.2放线菌分离（1）．制备土壤稀释液称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。
（2）．涂布分离用无菌移液管分别吸取上述10－5、10－4、10－3、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。
每个稀释度涂两个平板。
（3）．培养将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养5～7d后观察结果。
2.2.3霉菌的分离（1）．制备土壤稀释液称取土样5g，加入盛有95ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。
（2）．涂布分离将已灭菌的培养基溶化，加入链霉素溶液，待培养基凝固后，用无菌移液管分别吸取10－4、10－3、10－2、三个稀释度菌悬液0.1mL，涂平板。
每个稀释度涂两个平板。
（3）．培养将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养3～5d后观察结果。
2.2.4酵母菌的分离（1）．制备菌悬液称取面曲1g，加入加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，用玻璃帮将面曲捣碎，振荡20min，即成10－2稀释度的面曲稀释液。
（2）．涂布分离用无菌移液管分别吸取10－6、10－5、10－4、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。
每个稀释度涂两个平板。
（3）．培养将涂好的平板放于30℃恒温培养箱中培养2～3d后观察结果。
2.3纯培养菌种的菌落、菌体形态观察2.3.1菌落形态特征的观察由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特征及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上的生长状况也不一样。
根据微生物的固体培养基上相成的菌落特证，可初步辨别它们的分类地位。
观察时，应注意菌落的形状，大小、表面结构、边缘结构、颜色、透明度、气味、黏滞性、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况等。
通常，细菌菌落多为光滑型、湿润、质地软，表面结构及边缘结构特征很多，具有各种颜色。
但也有干燥、粗糙的菌落，甚至呈霉状但不起绒毛。
酵母菌菌落呈圆形，比细菌菌落大，表面光滑，质地软，颜色多为白色或红色。
放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与培养基结合紧密，不易被挑取。
菌落表面呈粉状或皱褶呈龟裂状，具有各种颜色，正面和背面颜色不同。
霉菌菌落长成绒状或棉絮状，能扩散生长，疏松，很容易挑取。
也具有各种颜色，如白色，绿色，灰色等，正面和背面不尽相同。
2.3.2细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌落特征的比较对分离培养出来的细菌，酵母菌，放线菌及霉菌的菌落特征仔细观察，并将上述四种微生物进行比较，做仔细记录。
2.3.3细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌体形态的观察对细菌和放线菌进行简单染色，对霉菌及酵母菌不做染色直接制片，观察这四种微生物的菌体形态。
3.实验结果表3-1形状颜色质地表面光泽与培养基结合程度菌体形态菌落特征名称细菌圆形白软光滑易挑起小杆状放线菌粉状乳白硬粗糙难挑起丝状霉菌絮状白软粗糙易挑起圆形有菌丝酵母菌圆形乳白软光滑易挑起椭圆4.结果与讨论通过实验的结果，我门可以发现这四类微生物的菌落特征，对比他们的相同点和不同点。
根据不同微生物对环境的适应能力不同，我们可以添加一些特定抗生素（如链霉素），抑制其他细菌生长，从而筛选出我们所需的特定菌种。
参考文献[1] 沈萍.微生物学.高等教育出版社，2006。