第一节 病毒感染的分子生物学检验策略
大约70%的人类感染性疾病是由病毒引起的,有超过400 种以上的病毒可感染人类。 病毒除引起急性感染外，与其他的病原微生物相比，导 致持续性感染比较多见。所谓持续性感染是指在原发感 染之后病毒不能从宿主中被清除，并且继续存留在机体 特定的细胞中。病毒在机体内可持续数月至数年，可出 现症状，也可不出现症状而长期带毒，成为重要的传染 源，如HBV、HIV等。因此对病毒感染的个体进行动态监 测病毒载量、分析病毒感染类型、检测耐药基因及抗议 病毒疗效观测等显得尤为重要。
第八章 病毒感染的分子生物学 检验
感染性疾病是由特定病原体感染机体后所产生的 一类疾病。病原体包括病毒、细菌、原虫、支原 体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和寄生 虫等。可采用微生物学、生物化学、免疫学和血 液学的方法对这些病原体进行检测，但是这些方 法受灵敏度和特异性的限制，在明确病因、潜在 感染、早期诊断以及对病原体进行分类、分型鉴 定等方面还存在着较大的缺陷。 随着分子生物学的突破性发展以及相关技术的进 步，优于传统诊断方法的分子诊断技术在疾病早 期诊断、疗效监测、耐药基因分析等凸显优势， 并被广泛应用于病原生物感染性疾病的检测中。
(二)乙型肝炎病毒基因组编码产物
HBV DNA主要有四个开放阅读 码框架，具有强大的蛋白质编 码功能。 pre-S1 pre-S2 S pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg
长链和短链DNA的5’端位置是固定的，但短链的3’端是 可变的。在负链的5’端一低分子量的蛋白质，在正链5’ 端有一段短RNA，它 们是引导DNA 合成的 引物。两条链的5 ’ 端 以250-300对碱基互 补结合 ，所以也称黏 性末端，是DNA保持 双链环状的基础，也 是HBV最常整合到肝 细胞染色体中的DNA。
Байду номын сангаас
在黏性末端的两侧还各有11个核苷酸 (5’-TCACCTCTGC-3’)构成的顺向重 复序列(DR)，DR1位于 长链的5 ’端，DR2位于 短链的5’端，中间相 隔223个核苷酸，DR是 DNA成环及病毒复制的 关键区域。
HBV基因组负链DNA核苷酸序列上含有6个开放 读码框架（ORF)，其中S、C、P、X 4个ORF 是早已公认的。 HBV DNA为了能在细 胞内独立复制，充分 利用其遗传物质，其 编码区有广泛的重叠， 以扩允其编码容量。 多个ORF 可读码2次 以上，编码2个以上蛋 白质。
一、病毒感染的一般性检出策略 病毒感染的分子诊断策略分为一般性检出策略和 完整性检出策略。 一般性检出策略，只能提供是否存在某种病病毒 感染，即针对病毒的特异性核酸序列通过常用核 酸杂交或PCR 技术直接检出病原体的核酸，临 床可用作判断有无感染和是何种病原体感染，是 快速诊断机体有无病毒感染的首选方法。 可以根据病毒本身的保守序列（如DNA分子中 的一个核苷酸片段或蛋白质中的氨基酸片段）设 计PCR引物或制备特异性探针。
1、S基因区 S基因区分为：前S1区、前S2区和S区。编码外膜蛋白， 前S区与病毒的嗜肝性有关。 S区和前S2区基因长度是固定的，前S1区基因在不同亚 型间有所差别，其氨基酸残基数在108~119范围。
2、C基因区 C基因区分为前C区和C区两部分。 C区由459 个核苷酸组成，编码产物为183 个氨基酸残 基组成的多肽序列，称为C蛋白（HBcAg）； 前C区由87个氨基酸残基组成，编码29个氨基酸残基组 成的多肽称为前C蛋白。 整个C基因区编码212氨基酸残基组成的多肽称为乙型 肝炎病毒e抗原（HBeAg）。
3、P基因区：是HBV DNA中最大的一个ORF，与其他基 因区均有重叠，编码产物是乙型肝炎病毒DNA的多聚酶 蛋白(HBV DNAP）。 P基因区中某些核苷酸也会发生点 突变，造成HBV DNA多聚酶的表达水平减少或完全阻断， 通过研究P基因的结构与功能，可进一步探索抗HBV治疗 的新方法。 4、X基因区：是HBV DNA中最小的一个ORF，编码产物 为x 蛋白(HBxAg)。 HBxAg 的氨基酸残基数在145~154 之间，功能尚未明确，可能是一种反式激活因子，与病 毒基因组的表达调控及 HBV DNA 的整合有关。x蛋白所 诱生的抗体常见于原发肝细胞癌患者体内。
清除病毒
反复清除
乙肝
肝纤维化 肝硬化 失代偿性肝硬化 肝癌
免疫功能正常 病毒清除
终生携带 无症状 无体征
e抗原/e抗体 血清转换 产生s抗体
一、乙型肝炎病毒的基因组结构特征
乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科。
嗜肝病毒科有独特的复制方式，病毒合成以RNA中间 体为模板，经反转录合成DNA链，在某些方面，HBV 与逆转录病毒有许多相似性。
（一）乙型肝炎病毒基因组结构
HBV DNA是带有单链区的环状双链DNA分子，是 已知可感染人类最小的DNA病毒。 基因组长为3.2kb，相对分子量为(1.6~2.0)ⅹ106。 HBV的两条链长度不等。长链为负链L(-)：长度固 定，携带有病毒全部的编码 信息。为模板编码病毒蛋白； 短链为正链S(+)：在不同的 分子中长度不等，约负链的 50%～100%。
二、病毒感染的完整性检出策略
完整性检出策略，即不仅对病原体的存在与否 做出明确判断，同时能够诊断出病毒携带者和 潜在性感染者，并能对病毒进行拷贝数测定、 基因分型（包括亚型）检测和耐药性鉴定。常 采用核酸杂交、PCR、基因芯片和DNA测序等 技术。
第二节 乙型肝炎病毒的分子生物学检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是 引起病毒性肝炎的主要病原体之一。根据有 关资料统计，全球约有3.5亿乙肝病毒携带 者，我国约50％~70％的人群感染过乙肝病 毒，其中乙肝病毒携带者已超过1.3亿，肝 癌发病率也在增加。
HBV 感染后可以引起急性、慢性病毒肝炎，而 且与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切的 关系。
缓解
急性感染
稳定
代偿性肝硬化 肝硬化 肝癌
慢性肝炎
死亡
慢性携带者
疾病进展 30-50 年
非代偿性肝硬化
HBV感染者的可能转归
13岁
免疫系统
25-30岁
免疫系统 免疫功能低下 慢性
425岁
识别病毒
幼年 感染 终生不识别