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高效液相色谱定性定量分析方法+++


RS变化值 1.6
按流动相组成分:单组分和多组分 按极性分:极性、弱极性、非极性 按使用方式分:等度洗脱和梯度洗脱

水: 去离子水 纯净水 自动纯水仪 商品瓶装水

溶剂: 色谱纯(甲醇,乙腈,乙醇,丙酮,异丙醇)

试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质要 求越高放置时间越短。
图1;好的梯度系统
图2;一般的二元梯度系统
图3;一般的四元梯度系统
五个小肽的5ng进样,好的色谱系统非常容易鉴别出所有 峰。在不好的色谱系统中,第一个峰则消失在基线噪音中。
1.183
Caffeine @ 271 nm
1.183
1.224
线路过滤器
单向阀 柱塞密封圈 进样器
检测器
吸滤头



1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 AU 0.70
UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank
H20 with 0.1% TFA 50% ACN with 0.1% TFA
固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时,柱效将明显下降,选合适
的溶剂进行洗净。
采用梯度洗脱时,柱在重复使用前,用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子,以重新建立起始的平衡来得到再 生。


对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系;并 且所设计的校正技术应该促进这种关系
( 4 )强烈滞留的组分不容易残留在
柱上, 保持柱性能长期良好; ( 5 )下次分析时 , 流动相需要一段 平衡时间;不同溶剂的 UV吸收程度稍 有差异, 可能会引起基线漂移
① A 流动相/弱溶剂组成; ② B 流动相/强溶剂组成; ③ 梯度时间;
强溶剂 A%
④ 梯度曲线:线性、凸型或凹型等。
time
N




目前实验室中最流行的选择 ◦ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器(其中50%是多 波长,25%是PDA) 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大


这种检测器简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术 可以作梯度实验并且是非破坏性的 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以
在分析前、柱平衡得差不多时,打开检测器;在分析完成 后,马上关闭检测器。 样品池要保养
谢谢!
今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄
吸滤头--定期清洗,更换溶剂时 单向阀--定期清洗,压力波动大时 泵--自动清洗 在线过滤器-压力大时清洗
吸滤头
材料:不锈钢烧结,孔径10um
故障:堵塞 表现:管路中不断有气泡生成
措施:用5%稀硝酸,超声波清洗,
再用蒸馏水清洗
单向阀
故障:宝石球或塑料垫片受污导致密封不好
表现:系统压力波动大
措施:
固定滞后体积,改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右),再补充新的
使用流动相尽量要清洁; 进液处的砂芯过滤头要经常清洗; 流动相交换时要防止沉淀; 避免泵内堵塞或有气泡; 每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污 染;



柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动; 当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净; 要注意流动相的脱气; 避免使用高粘度的溶剂作为流动相; 进样样品要提纯; 严格控制进样量; 每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品; 每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱; 若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;

打开排液阀,以异丙醇为流动相输液 拆下单向阀,放入异丙醇中,超声波清洗
线路过滤器
故障:堵塞
线路过滤器
现象:系统压力波动大或压力 偏高
压力传感器
措施:5%稀硝酸,超声波清洗
判断依据:关闭排液阀,断开出 口管路,设定流速1mL/min, 如压力>3kgf/cm2,则堵塞。
排液阀 流动相



柱内 体积 (Vm)
0.10 mL 0.06 mL 0.03 mL
平衡时间 流速 0.2 mL/min
5 min 3 min 1.5 min
1.0mL/min
60 sec 36 sec 18 sec
单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
色谱柱清洗保存
5 2 1
3
2
1

低压梯度 ◦ 用单泵产生梯度,泵前(低压端)混合 ◦ 对脱气要求高
◦ 不易调节梯度的滞后体积

如设计不当,梯度的 准确性受影响 ◦ 滞后体积(系统 体积)设计合理
低 压 梯 度
A
B D
C
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
色谱柱 进样器 检测器
比例阀
滞后(系统)体积 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 滞后(系统)体积 高 压 梯 度
检测器 柱温箱 流动相 脱气装置 样品盘
控温箱
四元

启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源, 待设备通过自检后,打开计算机启动
色谱管理软件
准备流动相 过滤,脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵
◦ 输液系统 ◦ 进样系统 ◦ 分离系统
◦ 检测系统
◦ 数据记录处理系统
液相色谱流程图
HPLC色谱柱 溶剂 自动进样器 色谱泵 检测器 废液
数据处理系统
色谱柱:Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流动相:27%甲醇:73%磷酸 pH: 2.5&2.6 温度: 50℃ 流速: 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形
3)检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相:
室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相:
当日现配现用: 低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相:
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
(1)改善分离, 加快分析速度; ( 2 )改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于 痕量组分的检测; (3)增加峰容量;
溶剂输送 系统(泵)
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
色谱柱
进样器
溶剂输送 系统(泵)
梯度混合器
检测器

滞后体积太大会引起梯度变化的延迟
◦ 例如:滞后体积为2.0ml,流速1.0ml/min
实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应,没有问题 ◦ 对微柱色谱影响更大,同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应,不能接受

滞后体积的不同会使方法转换麻烦 ◦ 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 ◦ 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好

普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml


设计不好的HPLC系统,滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果: 梯度的准确性不好,造成:方法的适应性不好 用静态梯度混合器;固定滞后体积可明显改善梯度特性
色谱柱 尺寸 (mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
柱内 体积 (Vm)
0.5 mL 0.3 mL 0.15 mL 1.54 mL
平衡时间 流速 1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
色谱柱 尺寸 (mm)
2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 15
Parabens at 254 nm
0.15
0.10 AU 0.05 0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Minutes
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00




由于不是所有化合物都有吸光度,因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时,需要使用多波 长检测,或使用折衷的波长 受流动相组成的影响: ◦ 用截止波长以上至少5~10nm作为工作波长 ◦ 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响




高灵敏度;可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 ◦ 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性


灵敏度是信号与噪音的比值;即峰高与基线噪音的比值 (S/N) 6:1 检测限(LOD):S/N = 2~4 定量限(LOQ):S/N = 8~10 好的信噪比有利于: ◦ 更好的色谱峰确认 S ◦ 更好的定量 ◦ 更好地完成色谱峰纯度/均一性

理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水,并通过0.22um
的滤膜,除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气

过滤:0.45um或更小孔径滤膜 目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是 使用无机盐配制的缓冲液。
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