高效液相色谱法（HPLC） 及定性定量分析
提纲
一﹑HPLC系统简介
二﹑HPLC中的固定相和流动相
三﹑应用范围 四﹑定量定性分析
一、HPLC系统
HPLC系统
输 液 泵
进 样 器
色 谱 柱
检 测 器
数据 记录 及处 理
HPLC示意图
输液泵
输液泵： 输液泵是HPLC系统中的重要部件之一， 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和 分析结果的可靠性。
定量分析
1.归一化法 归一化法要求所有组分都能分离并有响 应。由于液相色谱所用检测器为选择性检测 器，对很多组分没有响应，因此液相色谱法 较少使则归一化法。 2.外标法 外标法是以待测组分纯品配制标准试样 和待测试样同时作色谱分析来进行比较而定 量的，可分为标准曲线法和直接比较法。
3.内标法 内标法是比较精确的一种定量方法。它 是将已知量的参比物（内标物）加到已知量 的试样中．那么试样中参比物的浓度为已知 ；在进行色谱测定之后，待测组分峰面积和 参比物峰面积之比应该等于待测组分的质量 与参比物质量之比，求出待测组分的质量， 进而求出待测组分的含量。
泵应具有的性质： 1. 流量稳定； 2. 流量范围宽； 3. 输出压力高； 4. 液缸容积小； 5. 密封性能好，耐腐蚀。
操作时的注意事项：
1. 防止任何固体微粒进入泵；
2. 流动相不含有任何腐蚀性物质；
3. 工作时要注意溶剂瓶中的溶剂用完；
4. 泵的工作压力不能大于规定的最大压力；
5. 流动相要先进行脱气，防止产生气泡。
检测器
检测器是HPLC系统的三大关键部 件之一，作用是把洗脱液中的组分的量 转化为电信号。HPLC的检测器要求是 灵敏度高，噪音低，线性范围宽，重复 性好，适用范围广等特点。
数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计 算机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更 加迅速，简便，准确，精密和自动化，现在 已经可以在互联网上远程处理数据，目前计 算机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。谢 Nhomakorabea大家!!!
应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥 发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不 同极性的有机化合物；生物活性物质和多种 天然产物；合成的和天然的高分子化合物等 。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物 、生物化工产品及环境污染物等，约占全部 有机化合物的80％。其余20％的有机化合 物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等 分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分 析。
3．利用紫外检测器全波长扫描功能定性 紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器 。全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外 光谱图提供一些有价值的定性信息。 传统的方法是在色谱图上某组分的色谱出现极大值 即最高浓度时，通过停泵等手段，使组分在检测池中滞 留，然后对检测池中的组分进行全波长扫描，得到该组 分的紫外—可见光谱图；再取可能的标准样品按同样方 法处理。对比两者光谱图即能鉴别出该组分与标准样品 是否相同。对于某些有特殊紫外谱图的化合物，也可以 通过对照标准谱图的方法来识别化合物。
定性分析
常用的液相色谱定性方法有： 1. 利用已知标准样品定性 利用标淮样品对未知化合物定性是最常
用的液相色谱定性方法。由于每一种化合物
在特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱 、桂温等相同），其保留值具有特征性，因
此可以利用保留值进行定性。
2．利用检测器的选择性定性
同一种检测器对不同种类的化合物的响 应值是不同的，而不同的检测器对同一种化 合物的响应也是不同的。所以当某一被测化 合物同时被两种或两种以上检测器检测时， 两个或几个检测器对被测化合物的检测灵敏 度比值是与被测化合物的性质密切相关的， 可以用来对被测化合物进行定性分析，这就 是双检测器定件体系的基本原理。
HPLC的固定相和流动相
固定相：即所说的基质或者单体，可以 是陶瓷的无机物基质，也可以是有机聚合物 基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝，在
溶剂中不容易膨胀，有机聚合物基质主要是
交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有 机聚合物刚性小、易被压缩，溶剂或溶质容
易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结
果减少传质，最终使柱效降低。
固定相的种类： 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚合物 固定相的选择：（+++表示好，++表示一般，+表示差
）
流动相： 一个理想的流动相溶剂应具有低粘度、 与检测其兼容性好、易于得到纯品和低毒性 的特征。 选择流动相要考虑的因素： 1.流动相应不改变填料的任何性质； 2.纯度； 3.必须与检测其匹配； 4.粘度要低； 5.对样品的溶解度要适宜； 6.样品易于回收。
进样器
进样器： 目前采用较多的是六通 进样阀和自动进样器。 对进样装置的要求： 密封性好，死体积小， 重复性好，保证中心进样， 进样时对色谱系统的压力、 流量影响小。 进样方式可分为： 隔膜进样、停流进样、阀进 样、自动进样。目前应用做多的 是阀进样和自动进样。
色谱柱
色谱柱的要求： 柱效高、选择性好，分析 速度快等。市售的用于HPLC的 各种微粒填料好多孔硅胶以及以 硅胶为基质的键合相、氧化铝、 有机聚合物微球(包括离子交换 树脂)、多孔碳等，其粒度一般 为3，5，7，10μm等，柱效理 论值可达5～16万/米。对于一 般的分析只需5000塔板数的柱 效;对于同系物分析，只要500 即可;对于较难的分离物质对则 可采用高达2万的柱子，因此一 般10～30CM左右的柱长就能 满足复杂混合物分析的需要。