基本格式：
例如：实验三柠檬酸发酵
1. 实验目的
2. 实验原理
3. 实验装置与流程
4. 实验步骤及方法
5. 实验数据处理
6. 实验报告
7. 结果与讨论
8. 主要符号说明
9. 参考文献
10. 预习与思考
注：以上格式根据不同实验要求，可以删减或增加。

四、几点说明
1参考文献一般不要早于1995年。

2每一个实验的字数原则上控制在1000~3000字范围内。

为使本书成为精品，不刻意分配字数，一切从需要出发。

3专业名称和物料名称等专业词汇以手册和国标为准。

4篇末署名例：XXX大学XXX XXXX@XXXXX。

5以提高学生的实践能力，启发创新性思维为目标。

本次修订计划在原第一版编者之外，邀请熟悉所列题目，具有科学研究和技术开发经验的教师和企业人员撰稿。

本书部分实验方法用于教学实验，部分用于学生的毕业论文的实验和课外科研活动，也作为科学研究和技术开发的参考。

本书主要面向生物工程专业本科生，兼顾研究生、技术职业学院学生，教师和企业技术人员。

所有参加人员自然为本教材编委会委员。

实验48 酶连续反应操作技术（酶的固定化生产果葡糖浆）
1、实验目的
掌握包埋法制备固定化酶的技术，学习果糖含量的测定方法，了解填充床固定化酶反应柱连续生产果葡糖浆的工艺。

2、实验原理
蔗糖在生产、生活中有着广泛的应用，为补充蔗糖来源的不足，人们利用微生物酶将淀粉水解获得葡萄糖，但葡萄糖的甜度不及蔗糖，利用葡萄糖异构酶把葡萄糖异构成果糖，则可解决这一问题。

葡萄糖异构化反应平衡时，可将40～50%的葡萄糖转化为果糖。

人们将这种葡萄糖与果糖混合的糖浆称为果葡糖浆或高果糖浆。

固定化酶，就是把游离的水溶性酶，限制或固定于某一局部的空间或固体载体上，使其保持活性并可反复利用的方法。

固定化酶技术解决了游离的溶液酶，在反应过程中会随着产品一起流失，影响产品的质量；反应后分离困难，无法重复使用；对热、强酸、强碱和有机溶剂等均不够稳定等缺点，保持了催化效率高、稳定性强等优点，自20世纪60年代末，日本田边制药公司将固定化氨基酰化酶用于氨基酸生产以来，固定化技术已在生化工程及酶工程领域中成为各国学者的研究热点。

常用的固定化酶的方法主要有：载体结合法、交联法和包埋法。

包埋法是将酶（细胞）包在凝胶微小格子内，或是将酶（细胞）包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。

包埋法是制备固定化细胞最常用的方法，此法的优点是：酶分子本身不参加格子的形成，大多数酶都可用该法固定化，且方法较为简便；酶分子仅仅是被包埋起来而未受到化学作用，故活力较高。

可用于包埋的聚合物有：胶原、卡拉胶、海藻酸钙、聚丙烯酰胺凝胶等，其中海藻酸钙包埋法应用较为广泛。

海藻酸钠为天然高分子多糖，具有固化、成形方便、对微生物毒性小等优点。

利用海藻酸钠固定化酶操作简便、安全、成本低廉。

本实验采用海藻酸钙包埋法，以葡萄糖异构酶为材料连续生产果葡糖浆。

3.实验仪器及材料
（1）实验仪器
10mL注射器、恒流泵、烧杯、烧瓶、玻璃夹套柱、磁力搅拌器、超级恒温水浴、分光光度计。

（2）实验材料
葡萄糖异构酶、40%葡萄糖溶液、4%海藻酸钠溶液、0.05mol/LCaCl2溶液、pH7.8磷酸缓冲液、无菌生理盐水、MgSO4·7H2O、1.5%半胱氨酸盐酸溶液、0.12%咔唑无水乙醇溶液、69%（v/v）硫酸溶液、50μg/mL标准果糖溶液。

4.实验流程
40%葡萄糖溶液固定化酶颗粒4℃过夜
生理盐水清洗装柱60℃收集反应液咔唑比色法
计算果糖含量计算葡萄糖转化率
5. 实验步骤及方法
（一）固定化葡萄糖异构酶的制备
(1) 将海藻酸钠溶解于100mL蒸馏水中，100℃水浴溶解。

(2) 将20g葡萄糖异构酶加入100mL pH7.8的磷酸缓冲液中，充分混匀。

(3) 将葡萄糖异构酶溶液与海藻酸钠溶液按体积比1：2混合。

(4) 通过注射器将海藻酸钠-葡萄糖异构酶混合液滴入连续磁力搅拌的CaCl2溶液中。

(5) 收集固定化酶颗粒，置于CaCl2溶液中，4℃过夜。

（二）固定化葡萄糖异构酶连续生产果葡糖浆
(1) 用无菌生理盐水充分洗涤固定化酶颗粒。

(2) 开启超级恒温水浴，温度调节为60℃。

(3) 倾去浸泡固定化酶的生理盐水，将固定化酶颗粒装入玻璃夹套柱内，保持60℃恒温。

(4) 以0.1g/L向葡萄糖溶液中加入MgSO4·7H2O，充分溶解。

(5) 利用恒流泵，将加入MgSO4·7H2O的40%葡萄糖溶液自反应柱底部泵入。

(6) 收集反应液，适当稀释，用半胱氨酸-咔唑法，在560nm下测定样品的吸光值（操作见表1），并计算果糖含量。

（三）果糖标准曲线的制作
果糖标准曲线的制作方法见表2
表1 果糖含量的测定
5. 实验数据处理
记录所收集反应液的吸光值，并计算：
(1) 果糖含量：
6
10010
F n
W ⨯⨯⨯果糖（%）=
F ——由标准曲线所得果糖的量/μg; n ——样品稀释倍数； W ——样品质量/g ； 106——单位换算。

(2) 葡萄糖转化率：
10040
⨯样品中果糖百分含量
葡萄糖转化率（%）=
40——底物溶液中葡萄糖百分含量。

7. 结果与讨论
(1) 计算果葡糖浆中果糖含量； (2) 计算底物溶液中葡萄糖转化率。

8. 主要符号说明
F ——由标准曲线所得果糖的量/μg ; n ——样品稀释倍数； W ——样品质量/g 。

9. 参考文献
[1] 伦世仪. 生化工程[M]. 北京：中国轻工业出版社, 2003.
[2] 梅乐和，岑沛霖. 现代酶工程[M]. 北京：化学工业出版社, 2006.
[3] 刘住才，侯平然. 酶法生产果葡糖浆的发展[J]. 冷饮与速冻食品工业,
2001,7(3):39～42.
[4] 蒋丽萍，张静. 果葡糖浆的特性及其在食品中的应用[J]. 新疆畜牧业,2009,3:39～
40.
[5] Ram Sarup Singh, Rajesh Dhaliwal , Munish Puri. Production of high fructose syrup
from Asparagus inulin using immobilized exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1[J]. J Ind Microbiol Biotechnol . 2007, 34:649～655.
[6] 游新侠，仇农学. 咔唑比色法测定苹果渣提取液果胶含量的研究[J]. 四川食品与发
酵.2007,43(1):19～22. 10. 预习与思考
(1) 包埋法制备固定化酶的操作中，重点应掌握哪些技术环节，本实验固定化方法的适用性？
(2) 结合本实验，试说明填充床固定化酶反应柱的特点。

齐齐哈尔大学， 田英华，yinghua_tian@。