单倍体诱导技术在玉米育种中的应用刘培勋;刘和平;罗仁革;方军;黄成玺;曾锂【摘要】单倍体技术在种质改良和品种选育上具有显著的优势,已在实践中得到广泛应用.遗传诱导是获得单倍体最有效的方法.本文对单倍体育种的概况,单倍体的诱导,鉴定和染色体加倍的方法及发展情况进行了综述,并讨论了该技术在玉米育种中的应用.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2014(033)005【总页数】4页(P49-52)【关键词】玉米;育种;单倍体【作者】刘培勋;刘和平;罗仁革;方军;黄成玺;曾锂【作者单位】四川省广元市农业科学研究所, 四川广元628017;四川省广元市农业科学研究所, 四川广元628017;四川省广元市农业科学研究所, 四川广元628017;四川省广元市农业科学研究所, 四川广元628017;四川省广元市农业科学研究所,四川广元628017;四川省广元市农业科学研究所, 四川广元628017【正文语种】中文【中图分类】S335.4;S513单倍体(haploid)指具有配子染色体数的细胞或个体。
双单倍体(doubled haploid，DH)是指单倍体细胞(n)经过自然或人工诱导染色体加倍而形成的一种纯合基因型(2 n)。
诱导单倍体技术就是利用单倍体诱导系通过杂交诱发产生单倍体，再通过染色体组加倍使植物恢复正常染色体数，从而获得纯合基因型的一种育种方法，也称作单倍体育种。
全世界已有250余种作物应用了双单倍体技术，12种作物培育出了来自于栽培种的DH系。
利用单倍体诱导系可明显提高亲本产生单倍体的概率，此法简单易行，是目前制备单倍体最常用、最经济的方法之一［1］。
诱导单倍体技术在玉米遗传育种上具有以下优点:(1)两代培育出纯系，相比常规的育种方法需要六、七年获得一个纯系，显著缩短了育种周期;(2)流程简单，大大减少了培育自交系所需时间、人力和财力;(3)使选择变得更高效和精确，尤其是与分子标记和全年种植的苗圃结合应用的时候;(4)通过快速聚集控制产量和抗性的有利基因来培育或改良自交系，较传统方法简单、省时;(5)DH系没有显性基因的的掩盖，由隐性基因控制的性状容易显现，有助于研究诱变育种和突变遗传，同时在选择时能够淘汰不利的隐性性状个体;(6)为从事标记－形状连锁研究，功能基因组学，分子细胞遗传学和遗传工程研究提供了更好的选择［2］。
单倍体育种技术与常规育种技术的有机结合，提高了育种的效率，开辟了育种的新途径，成为选育自交系的重要手段。
玉米是世界三大粮食作物之一，我国是世界第二大玉米生产国，玉米在国民经济中占有重要地位。
玉米单倍体的研究及DH系在玉米育种上的利用始于1947年，Chase最先将选育的优良DH系用于杂交种的组配［3］。
最初，人们依靠自然变异获得单倍体，其发生频率非常低，难以在商业育种中应用。
单倍体诱导系Stock 6(诱导率2.3%)的出现，标志着体内单倍体诱导体系的建立，单倍体育种取得重大突破，此后在Stock 6的基础上出现了一系列高诱导率的诱导系［4］。
过去的10～15年，双单倍体诱导系在温带地区取得了迅猛发展，欧洲、北美、中国等已将其广泛应用于商业玉米育种［5］。
然而，种植热带玉米的南美、非洲南部以及亚洲南部等地区研究却相对滞后。
玉米诱导单倍体育种的一般步骤为:(1)诱导系作父本与基础材料杂交，基础材料一般是杂交种或由杂交种自交选出的F2代;(2)利用花青素颜色标记鉴别单倍体种子;(3)单倍体种子发芽生长;(4)秋水仙素或其他有效的加倍剂处理幼苗，使其染色体组加倍;(5)适当的农艺性状调查及D 0代植株自交，衍生出D 1代植株(DH);(6)进一步在育种中选择利用双单倍体系。
本文就玉米育种中诱导单倍体技术的应用进行了探讨，以期为进一步优化和完善玉米单倍体育种技术，及其在我国推广、应用提供参考。
体内诱导母本产生单倍体是一种高效的单倍体育种方法，现有的商业化双单倍体系育种项目都是建立在此基础上。
虽然过去有些科研单位通过体外诱导的方法获得了DH系，但是一些因素限制了其发展，例如:许多玉米基因型无响应，此外还需要完善的配套实验室和专业的技术人员等。
相对而言，体内诱导单倍体更加简单，诱导系Stocks的遗传力以及引入花青素颜色标记，使遗传学家鉴定单倍体种子和幼苗非常方便，促进了更多高诱导率的单倍体诱导系的出现［6］。
关于诱导母本产生单倍体通常有两种假说:(1)诱导系提供两个精子，其中一个有缺陷，但是也能与卵细胞结合，融合后的细胞在细胞分裂过程中来自诱导系的染色体逐渐退化，最后消失，另一个精子与中心细胞结合，形成三倍的胚乳细胞;(2)两个精子中的一个不能与卵细胞结合，但能触发母本胚胎发生，另一个精子与中心细胞结合发育成胚乳［7］。
这样就导致同一个果穗上同时出现一定概率的单倍体籽粒(n)和大部分的二倍体籽粒(2 n)，单倍体籽粒同样具有三倍的胚乳(3 n)，具有和正常植株一样的萌发能力。
1959年，Coe发现玉米单倍体诱导系Stock 6在作为父本对其他品系授粉杂交时可以产生一定概率的母本单倍体，首次使玉米单倍体诱导选系理论在实际中得到应用。
从此，玉米单倍体诱导系的研究取得了飞速的发展，大量具有高诱导率和商业应用价值的诱导系开始涌现。
温带的诱导系主要包括:(1)KMS和ZMS，都来自Stock 6;(2)WS14，W23 ig与 Stocks杂交而来;(3)KEMS(Krasnador Embryo Marker Synthetic);(4)MHI(Moldovian Haploid Inducer)，KMS和 ZMS杂交而来;(5)RWS(Russian inducer KEMS+WS 14)，KEMS和WS14杂交的后代;(6)UH 400，由霍恩海姆大学从KEMS中选出;(7)PK 6;(8)HZl 1，由Stock 6得到;(9)CAUHOI，中国农业大学使用Stock 6与高油群体杂交而来;(10)PHI(Procera Haploid Inducer)，MHI和Stock 6杂交而来。
2007年以来，温带的诱导系UH 400，RWS，RWS×UH 400已在 CIMMYT的热带和亚热带种质圃应用成功。
目前，温带诱导系还不太适应热带的低海拔环境，高效的、大规模的在热带应用温带诱导系还存在着很多问题，如:花粉活力低，结实率低，热带病害严重等。
相比而言，热带诱导系的研究则相对缓慢，自2007年CIMMYT全球玉米工程集中在热带、亚热带玉米主栽地区优化双单倍体技术以来，才创制出适应热带种植的单倍体诱导系TALLs，其诱导率达到9%～14%。
我国利用单倍体诱导选系开展较晚，但取得了很大的成就。
刘志增等［8］对Stock 6进行了遗传改良，将高油玉米群体BHO与单倍体诱导系Stock 6进行杂交，选育成了农大高诱1号。
这是我国第一个玉米母本单倍体诱导系，它结合了ABP1紫色植株标记和独特的大胚面标记，平均单倍体诱导率为5.34%。
才卓等［9］从Stock 6与M 278杂交后代中选育成了吉高诱系3号，诱导率高达10.40%。
鉴定诱导产生的单倍体方法很多，包括细胞遗传学方法、形态学方法、解剖学方法、射线照射法、生理生化方法、分子生物学方法和遗传标记法。
其中，遗传标记法是最简单可行、应用最广泛的方法，其鉴定主要依靠显性的花青素颜色标记R 1-Navajo(R 1-nj)，该标记在诱导系胚和糊粉层表达。
基础材料一般没有这种标记，这样R 1-nj使得单倍籽粒与二倍籽粒能够清楚分别，大部分籽粒具有紫顶、紫胚芽或顶部、胚芽均无标记性状的为二倍体，小部分籽粒具有紫顶而胚芽是白色为单倍体［10］。
此外，可将籽粒顶部紫色和白色胚芽的拟单倍体籽粒进行单粒播种，利用单倍体植株具有细弱，柱头长，花粉粒小而空瘪，植株矮化等特点，可以根据植株长势、形态进一步鉴定单倍体。
依靠R 1-nj遗传标记鉴选单倍体虽然有效，但是仍然有些问题:(1)当基础材料含有显性的花青素抑制基因(C 1-l，C 2-ldf，In 1-D 等)时，R 1-nj完全不表达，使得单倍体籽粒无法鉴别。
目前的测试研究表明，单倍体诱导系与不同基础材料杂交时，R 1-nj基因表达被抑制的概率为8%左右;(2)单倍体的鉴定只能人工完成，只有受过系统培训的技术员才能够通过颜色表达情况准确、快速地鉴别出单倍体;(3)收获时玉米籽粒的含水量也会影响颜色的鉴定。
当鉴别单倍体干种子困难时，拥有花青素基因B 1(Booster 1)和Pl 1(Pueple1)的诱导系也能用于鉴别单倍体，他们能使胚芽鞘和根呈现紫色［11］。
为了避免由于花青素标记的低表达造成单倍体鉴别错误，育种家提出将玉米籽粒的含油量作为标记，用于鉴别单倍体，利用核磁共振技术可以轻松测定籽粒含油量。
Li等［12］在Stock 6后代中选出高含油量(78g/kg)的诱导系，这使得单倍体的鉴选可以同时通过R 1-nj相关的子叶着色缺失或胚的含油量高低来实现。
2012年，Jones等［13］试验利用近红外光谱区分单倍体和杂种玉米籽粒，这个方法成功鉴定了不同基因型混合种子中11/13的单倍体和25/25的杂种。
单倍体自然加倍发生的概率非常低，远不能满足玉米育种的要求，利用化学试剂处理可以提高单倍体加倍的频率。
这些化学试剂能抑制细胞的有丝分裂，使染色体加倍。
目前使用较多的染色体加倍剂是秋水仙素，它最初来源于秋水仙的鳞茎，是一种水溶性的生物碱，味苦，有毒。
有丝分裂中期，秋水仙素能制约微管蛋白、抑制纺锤体的形成;到了后期，2个复制的姊妹染色单体分离，但不移向细胞的两极，而是停留在细胞的中心;末期，细胞内产生新的核膜将染色体全部包裹。
这样，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，就形成了含有加倍了染色体的细胞。
Gayen等［14］采用切除单倍体的胚芽鞘，然后用0.06%的秋水仙素和0.5%的DSMO混合液18℃处理12 h，使单倍体加倍取得了突破性进展。
Deimling等通过将根切至20～30 mm长，并在黑暗环境下进行浸泡处理，进一步增加了加倍效率。
秋水仙素处理后将幼苗仔细清洗后，放置温室长至5～6叶，然后可移栽到大田。
经过秋水仙素处理的幼苗大约三分之一能够完成散粉和自交，最后产生种子。
在秋水仙素溶液中添加一些辅助剂(DMSO、吐温和细胞分裂素等)可提高加倍效率。
目前常用的加倍方法主要采用浸种法、浸根法和注射法等对玉米单倍体的根尖或者茎尖生长点进行处理。
(1)浸种法:直接用秋水仙素溶液浸泡种子;(2)浸根法:用试剂浸泡根尖;(3)注射法:是指把试剂溶液注入玉米幼苗的一种方法。
目前，秋水仙素的诱导率大概在8% ～10%，然而，处理也不是总是有效。
此外，秋水仙素有毒，有致癌性，需要小心操作和安全清理。