玉米诱导系遗传多样性及诱导率与母本遗传背景的关系崔学宇;杨巍;任雪娇;慈佳宾;赵超;董莹;杨伟光【摘要】[目的]研究玉米单倍体诱导率与遗传背景的关系及诱导系的遗传多样性.[方法]选用东北地区主要的玉米杂种优势模式下骨干自交系所组配的F1代为母本进行单倍体诱导,统计诱导率;利用SSR标记对诱导系遗传多样性进行分析和类群划分.[结果]母本不同的材料间单倍体诱导率变异幅度较大,相同杂交模式下的基础材料间诱导率变化也较大,杂交模式间诱导率无显著差异;同一亲本组配的诱导基础材料的诱导率变化范围较大,不同亲本的组合间差异不显著.SSR标记分析表明,35对SSR引物共检测出152个等位基因变异,每对引物检测出2～7个等位基因,平均4.342 9个,每对引物多态性信息量(PIC)为0.113 7～0.676 5,平均为0.442 0.聚类分析结果表明,供试玉米诱导系分为4个大群,第2类群可以被划分为6个亚群.[结论]单倍体诱导率与母本基础材料的基因型有一定的相关性;供试诱导系可划分为4个大群;在对诱导系评价或父本诱导系改良时,应考虑测定母本基因型等综合因素.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)008【总页数】7页(P83-89)【关键词】玉米;单倍体;诱导系;SSR标记【作者】崔学宇;杨巍;任雪娇;慈佳宾;赵超;董莹;杨伟光【作者单位】吉林农业大学农学院,吉林长春130118;吉林农业大学农学院,吉林长春130118;吉林农业大学农学院,吉林长春130118;吉林农业大学农学院,吉林长春130118;吉林农业大学农学院,吉林长春130118;吉林农业大学农学院,吉林长春130118;吉林农业大学农学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】S335.4玉米育种成功与否很大程度上取决于选育方法和选择的准确性。
常规育种方法获得一个高配合力的纯合玉米自交系，平均需要4～5年的时间，进行连续7～8代的人工自交与选择[1]。
而利用单倍体技术诱导出单倍体后，经过染色体加倍便获得完全纯系，可以缩短产生纯合品系的时间。
因此国内外各大公司、科研院所和高等院校相继开展玉米单倍体加倍育种，以加速培育优良自交系，并应用于玉米育种实践[2-3]。
玉米诱导系在田间种植时，常常出现生花期不协调、花粉量小不能满足育种需要和抗逆性较差等问题。
研究发现诱导系诱导单倍体这一性状在遗传上主要表现为加性效应，还受显性及上位性效应的影响，诱导率可以通过选择提高[4-5]，另有研究发现诱导系诱导性状同样具有杂种优势，所以通过已育成诱导系间杂交继续改良诱导系或应用诱导系杂交种F1作为诱导材料进行单倍体诱导，是保证诱导率条件下解决上述问题的可行手段[6-7]，因此对已育成诱导系类群的划分在诱导系改良应用上具有重要的意义。
Sarkar等[8]研究表明，单倍体诱导率的高低还受母本材料以及诱导条件和诱导环境等诸多因素的影响，研究母本基因型对诱导率的影响，对现有诱导系的改良有一定的指导作用。
本研究选用东北地区主要的玉米杂种优势模式下骨干自交系所组配的F1代为母本进行单倍体诱导，统计诱导率，并利用SSR标记对本课题组收集、改良的82份诱导系遗传多样性进行类群划分，以期为已有诱导系材料的改良以及提高诱导系的诱导效率、充分发挥诱导系的诱导效能提供理论依据。
1.1 供试材料母本为不同杂交模式人工组配的24份选系基础材料(表1)，涵盖了东北地区常用的自交系及主要的杂种优势模式。
以本课题组选育的诱导系JS6-2、JS6-6、JS6-11、JS3-11和JS3-12为杂交共同父本，即将花粉混合均匀授粉，各父本诱导系花粉量大、抗病性好、持粉时间长[9-10]。
诱导系遗传多样性研究材料为本课题组收集、改良的80份诱导系材料及Stock6、高诱1号合计82份诱导系，诱导系JS6-2～JS6-35田间编号为4D1～4D34，JS3-1～JS3-46田间编号为4D35～4D80，Stock6编号为4D81，高诱1号编号为4D82。
选用北京市农林科学院玉米研究中心筛选与鉴定所设计的适于中国玉米种质资源研究的40对核心标记作为SSR标记[11]。
1.2 试验方法1.2.1 大田种植管理2013年冬将24个杂交组合(母本材料)种植于吉林农业大学三亚玉米育种基地，每个材料种植1行，行距65 cm，株距25 cm，于母本吐丝后3～4 d以诱导系混合花粉授粉，每个材料杂交10～20穗，收获后选择结实较好的果穗混合脱粒，进行单倍体的初步鉴定，其中胚乳有紫色标记而胚无紫色标记的籽粒为拟单倍体，所有拟单倍体于2014年春种植于吉林农业大学长春玉米育种基地进行进一步的种植鉴定，其中单倍体表现为植株矮小、叶片和茎秆绿色、多为不育，根据田间鉴定结果统计不同基础材料的单倍体诱导率[12-14]。
单倍体诱导率=(准单倍体籽粒数/诱导的总籽粒数)×100%。
试验原始数据先在Excel 2003软件中进行处理，再用DPS 7.1软件进行数据分析[15]。
1.2.2 诱导系遗传多样性分析诱导系材料DNA的提取参考宋恩亮[16]的SDS方法，并根据本实验室条件加以改良。
取少量幼嫩玉米叶片装入预先加入钢珠的2 mL离心管中，液氮冷冻后利用打样机充分打碎，在装有样品的离心管中加入800 μL预热的SDS抽提液，65 ℃水浴30～45 min，加入800 μL有机溶液，轻轻振荡10 min；在冷冻离心机中10 000 r/min 离心12 min；将上清液转入新的1.5 mL离心管中，加上清液体积1/10的 3 mol/L NaAc(约75 μL)和与上清液等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒摇晃 3～5 min，放入-20 ℃冰箱沉降过夜；10 000r/min 离心5 min，利用体积分数75%乙醇洗脱DNA沉淀2次；通风橱内风干DNA，当沉淀呈现半透明状时加100 μL TE溶解DNA原液，-20 ℃ 保存备用。
SSR反应体系参考张舒娜等[17]的条件，并由本实验室优化完成。
采用20 μL PCR 反应体系，其中包括10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.3 μL，引物共0.5 μL，2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，20 ng/μL DNA 4.0 μL，ddH2O 12.7 μL。
SSR反应条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共36个循环;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃结束并保存。
反应产物用7.2%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染拍照。
1.3 数据统计与分析根据SSR产物银染结果，有带记为1，无带记为0，建立数据库，利用UPGMA方法对各个自交系进行聚类，数据处理用NTsys 2.10e软件完成。
每一个多态性位点的多态性含量( PIC) 数据处理利用统计分析软件PowerMarker V3.25 完成。
2.1 基础材料的单倍体诱导率2.1.1 不同基础材料的单倍体诱导率由表1可知，在长春春播种植条件下，基础材料的单倍体诱导率变幅为1.09%～18.41%，其中PH6WC×郑58的单倍体诱导率为18.41%，444×四-144的单倍体诱导率为1.09%。
单倍体诱导率在10.00%以上的有K12×S122、黄早4×安昌7、444×安昌7、吉853×昌7-2；单倍体诱导率在2.00%以下的有吉853×丹340、丹9046×PHGJ4、沈5003×PHGJ4、444×四-144。
2.1.2 不同杂交模式下的单倍体诱导率由表2可以看出，塘四平头×塘四平头杂交模式下的单倍体诱导率均值最高(6.78%)，其次为Reid×Reid的杂交模式(5.83%)，塘四平头×旅大红骨杂交模式最低(5.39%)。
方差分析结果(表3)表明,不同杂交模式间单倍体诱导率无显著性差异。
2.1.3 具有相同亲本诱导基础材料的单倍体诱导率由表4可以看出，具有相同亲本基础材料的单倍体诱导率均值为4.53%～8.62%,其中PH6WC参与组配的单倍体诱导率最高(8.62%)，吉853参与组配的单倍体诱导率最低(4.53%)。
同一亲本参与组配的诱导基础材料间单倍体诱导率变异幅度都较大，除昌7-2作为组配亲本诱导率变异幅度小于9%外，其他亲本诱导率变异幅度都高于9%。
对统计值进行单因素方差分析，结果(表5)表明，6组间诱导率无显著性差异。
2.2 诱导系的遗传多样性及聚类结果40个标记中有35个标记条带清晰具有多态性(表6)。
由表6可以看出，筛选的35个标记在诱导系合计扩增到152个等位位点，平均每个标记 4.342 9个等位位点。
在这些标记中，等位变异最多的是umc2115k3和bnlg161k8，最少的是phi072k4。
35个标记平均PIC值为0.442 0，PIC值变化幅度为0.113 7～0.676 5，用于试验的82份诱导系的基因多样性平均值为0.491 5。
35个标记所揭示的基因多样性变化幅度为0.138 3～0.722 5。
根据82份诱导系遗传相似系数矩阵，利用UPGMA 方法对82份诱导系进行聚类分析,结果 (图1) 表明，以遗传相似系数0.65为标准，可以将82份诱导系划分为4个大类，其中第Ⅰ类群包含4D1和4D5 2个诱导系；第Ⅱ类群包含78个诱导系；第Ⅲ、Ⅴ大类各包含1个诱导系，分别为Stock6和高诱1号；以相似系数0.69为标准可以将第Ⅱ类群进一步划分为Ⅱa～Ⅱf 6个亚群。
3.1 诱导率的影响因素本试验在吉林长春同一诱导环境条件下开展单倍体的诱导率研究，并选择多种遗传背景的单倍体诱导系作为共同父本，避免了种植环境和诱导系遗传背景的影响。
本研究结果表明，母本基础材料的遗传背景影响单倍体诱导率，而不同杂交模式间单倍体诱导率高低无显著性差异，不足以决定诱导率的高低，具有相同亲本的基础材料组间诱导率也无显著性差异，这与丁照华等[18]的研究结果相似。
3.2 诱导系材料的遗传多样性基于核心标记所揭示的82份诱导系平均遗传多样性为0.491 5，平均等位变异数为4.342 9，低于前人基于SSR标记对中国普通玉米及糯玉米的研究结果[19]，但高于在甜玉米中的研究结果[20]。
其原因可能是普通玉米及糯玉米研究比较成熟，具有更广泛的种质资源，而甜玉米和诱导系材料都比较特殊，选育来源不够广，因此在以后的育种过程中应该注重自身拥有诱导系资源的研究和整理，并加强诱导系种质资源的引进和改良。