第十章 新酶的发现与筛选
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微生物作为酶源的优点
( 2 )培养简便、繁殖快、发酵周期短, 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。 ( 3 )微生物易变异,可采用各种遗传变 异手段,培育出新的、更理想的菌株。
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第10章 新酶的发现与筛选
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二、 微生物新酶的获取途径
购买商品化的酶
购买产酶微生物
获取途径 从自然界筛选产酶微生物
第10章 新酶的发现与筛选
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示例1 基因组序列搜索
查找基因组序列:Kluyveromyces lactis 搜索基因组序列中的还原酶 reductase
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2、 基因挖掘法
基因组狩猎原理
以已知酶为探针,与整个数据库的酶进行比 对,获得中等相似度( 50%~70% )的酶进行克 隆表达,通过功能筛选并获得所需要的酶。
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示例2 数据库比对寻找相似酶序列
酶探针的氨基酸序列
NADPH-dependent alpha-keto amide reductase [Kluyveromyces marxianus]
GenBank: BAP73216.1
1 61 121 181 241 301 MTNQKFFTLS AETYKTYPEL IHSPFFDKDL FSPFLQNQTP QVLLLWVYKR YTKYNSEAQK NGNKIPAVAV GAALKETKKP NIDLETAWKQ GIVEFSQKND GILPVTTSAK VGTGTKWYKA REEIFITDKF LEELYKSGKA ILLEAYSPLG IERIKQAQDI EETDATFSQE SSLHKISEDP KNIGVSNFTV PLQKKPADAD FSFDLTEEEV LTDIVKLSLD KSALETALKK EDLKKVLAIA QQPFYQYLKE KKITDLGLQH TVPGIVHIDA LGVDYVDLYL EIKPQVNQIE LSEKYNKTEA EPVRLYWVDF
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3、高通量筛选法
基于荧光发生的高通量筛选
采用荧光底物,经酶水解后释放荧光基团,用
高通量荧光计测定
伞形酮(无色)
伞形酮阴离子(蓝色荧光)
伞形酮筛选水解酶,如脂肪酶 ,磷酸酶 ,糖苷酶等
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第10章 新酶的发现与筛选
(1)种类繁多、分布广
微生物“无孔不入,随遇而安” 微生物具有多样性
① 物种多样性:据估计总类别在50万至600万之间 ② 生理代谢类型多样性:有机物和有毒物质分解、转化
③ 遗传基因多样性:已完成测序细菌1214种、古细菌93种、
真菌17种(2010年数据)
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第10章 新酶的发现与筛选
美国国立生物技术信息中心 网址:https:///
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1、 基因组狩猎法
基因组狩猎原理
对某一已经测序的微生物进行全基因组搜索
和分析,从而获得候选酶基因。
主要包括以下步骤: ① 分析全基因组序列,获得还原酶基因序列; ② 克隆所有基因并表达, 构建酶表达库;
淀粉酶:淀粉(底物)+ 碘液(指示剂) 氨基酰化酶:N-乙酰氨基酸(底物)+溴甲酚紫(指示剂) 溴甲酚紫,pH >6.2显紫色;pH <4.8显黄色
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1、平板筛选法
(2)透明圈法
在固体培养基中掺入溶解性差、可被特定菌 利用的营养成分,造成浑浊、不透明的培养 基背景,在产特定酶菌种菌落周围会形成透 明圈。
菌株依然存在,需要用合适的方法加以分离 分离纯化方法:稀释涂布或划线分离
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四、 从自然界筛选产酶微生物
4、初筛
平板筛选法 薄层层析法 高通量筛选法
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第10章 新酶的发现与筛选源自231、平板筛选法
(1)变色圈法
将指示剂掺入固体培养基中进行待选菌悬液 的单菌落培养,或将指示剂喷洒在平板单菌 落表面,指示剂与底物或产物反应,在菌落 周围形成变色圈。
从基因克隆库中筛选酶基因
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第10章 新酶的发现与筛选
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1、 购买商品化的酶
向酶制剂供应商购买商品化的酶
世界主要酶制剂供应商:Sigma、Novo Nordisk、 ThermoGen、Roche Molecular Biochemicals 等
特点:
方便易得,可大量供应 种类少、成本高、知识产权问题
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3、高通量筛选法
基于荧光发生的高通量筛选
不发荧光的试卤灵前体物质经过催化后 , 生成
了发荧光的试卤灵
3-苯基丁酸试卤灵
试卤灵(荧光)
试卤灵筛选酯酶
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四、 从自然界筛选产酶微生物
5、复筛
精确测定菌株产酶能力和催化活力,确认符 合生产要求的菌株。方法:HPLC、GC等
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2、 购买产酶微生物
从菌种保藏库购买酶来源微生物
国内外主要菌种保藏机构: ATCC 、 DSMZ 、 CCTCC、CICC、CGMCC
特点:
方便易得,成本较低(600-800元/株) 需要进一步筛选
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基于颜色变化的高通量筛选
反应生成有颜色的产物或有色的底物经反应后生成无色 的产物,或底物/产物与其他物质反应生成有色络合物
2,4-二硝基苯肼筛选还原酶
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3、高通量筛选法
基于颜色变化的高通量筛选
对硝基苯酚醚 (无色)
酚盐(黄色)
对硝基苯酚醚筛选水解酶
3、筛选方法
(2)高通量筛选法
方法:多孔板培养微生物,并用酶标仪进行 光谱分析。 原理:反应产物具有吸收峰值,发光或产生 荧光。
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四、 从自然界筛选产酶微生物
筛选流程
调查研究 查阅资料 采样 富集培养 分离纯化
性能鉴定
生产性能、毒性、菌种鉴定
扎紧,标明时间、地点、天气和周围环境等
信息。
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四、 从自然界筛选产酶微生物
2、富集培养
目的:使目的菌株大量繁殖,成为优势菌株 原理:根据微生物的特点,“投其所好”或 “取其所抗”,在培养基中投放或添加特殊
养分或抗菌物质,使天然环境中劣势菌转变
为人工环境中的优势菌。
淀粉→淀粉酶 酪素→蛋白酶 纤维素粉→纤维素酶
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几丁质→几丁质酶 吐温→脂肪酶 α-葡聚糖酶→1,3- α-葡聚糖
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第10章 新酶的发现与筛选
2、薄层层析法(TLC)
薄层层析
混合样品由于样本被点在薄片后,展开剂会 因为毛细现象而向上移动。不同的分析物因为极 性差异会以不同的速度向 TLC片上端爬升,因而 达到分离目的。
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生物化学 第6章 生物氧化
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高通量筛选采用的设备
96孔板
384孔板
1536孔板
深孔培养板
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多通道移液器
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酶标仪
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高通量筛选采用的设备
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3、高通量筛选法
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富集培养方法
(1)控制培养基的营养成分
在培养基中加入一定量底物,筛选生长优势菌株
加入底物作为唯一碳源或氮源
逐步提高底物添加浓度,连续富集培养 用不同的培养基筛选不同类型的微生物
细菌:牛肉膏蛋白胨培养基 放线菌:高氏一号培养基 霉菌:察氏培养基 酵母:豆芽汁培养基
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3、高通量筛选法
高通量筛选法的概念
以分子水平或细胞水平的实验方法为基础, 以多孔板形式为实验工具载体,以自动化操作系 统执行实验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实 验结果数据,以计算机对实验数据进行分析处理, 同一时间对成百上千的样品进行检测分析。
特点:准确 、微量 、灵敏 、快速和廉价
3、 从自然界筛选产酶微生物
从土壤、水体中筛选产酶微生物
广泛采用,盲目,工作量大
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第10章 新酶的发现与筛选
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3、 从自然界筛选产酶微生物
从基因克隆库筛选
克隆库构建方法:
基因组狩猎
基因挖掘
宏基因组筛选
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第10章 新酶的发现与筛选
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三、 新酶筛选的策略
第10章 新酶的发现与筛选
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三、 新酶筛选的策略
3、筛选方法
(1)分级筛选法
初筛:迅速定性或粗略定量鉴别,除去大多
数不符合要求的菌种或酶。平板筛选法、多
孔板法等
复筛:精确测定酶活,筛选出需要的酶或产 酶微生物。常采用HPLC或GC
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