次氯酸钙 9-10
易
5-30
很好5-30Fra bibliotek很好漂白粉 饱和溶液
易
5-30
很好
升汞
0.1-1
较难
2-10
最好
酒精
70-75
易
0.2-2
好
过氧化氢 10-12
最易
5-15
好
溴水
1-2
易
2-10
很好
硝酸银
1
较难
5-30
好
抗菌素 4-50 mg/L 中
30-60
较好
(二) 灭菌、消毒技术
物理方法：高压蒸汽灭菌、紫外照射 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌
动物克隆技术的建立
1891Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功，他们把安哥拉 家兔胚胎移植给比利时兔，得到了4只安哥拉家兔。 20世纪30年代以后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成 功。经过几十年的不断完善和充实，已成为一项比较成熟的 繁殖生物学技术。 1962年首例报道克隆动物成功，英国学者Grudon把非洲爪蟾 小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外 线照射杀死卵细胞核)中，约有1%的重组卵发育成为成熟蛙。 这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径。 其贡献在于：证明了动物细胞具有全能性；初步建立了 体细胞核移植实验体系，卵细胞质对体细胞核的发育功 能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中 的mRNA与有关的蛋白质。
细胞工程制药专题二
第一节 细胞工程实验室技术
2、辅助实验室
细胞学实验室对培养材料进行细胞学鉴定和研究。 要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿 和灰尘污染。 摄影室及暗室进行培养材料的摄影记录和暗室显影， 有条件可建立。 生化分析室以培养细胞产物为主要目的的实验室中， 应建立相应的分析化验实验室，以便对培养物的有 效成分随时进行取样检查。
Medicinal
Research Reviews
第三节 动物细胞工程制药
9
一、动物物细胞工程的发展
1907年R. Harrison将蛙胚神经管区一片组织移植到蛙淋巴液 凝块中，存活若干星期，长出了轴突(神经纤维)，表明利用体 外存活组织实验研究的可能性。 1911年Carrel把无菌技术引到了组织培养技术中，在不含抗菌 素的条件下，鸡胚心脏细胞维持生存了34年，继代3400次， 证明动物细胞可能在体外无限生长。 1914年Thomson创立了体外组织培养途径－器官培养法，以 后又被Strangeways和Fell所发展。 1940年Earle建立了无限传代的C3H小鼠结缔组织细胞系－L 系。 1951年Gay建立了第一个人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系 ➢ 动物组织细胞培养技术的建立和细胞融合技术促进了 动物细胞工程的蓬勃发展。
第二节 植物细胞工程制药
2
一、发展历史
细胞学和细胞全能性学说为组织培养技术的产生 奠定了理论基础。 ➢ Schleiden和Schwann分别于1838年和1839年提出细胞 学说(cell theory)：细胞是有机体，亦是生物体的基本 结构单位，由它构成整个生物个体。 ➢ 是1902年德国著名植物学家G. Haberlandt在细胞学 说的基础上提出细胞全能性学说。所谓植物细胞全能 性(totipotency)是指每一个活细胞都具有产生一个完整 个体的全套基因，在适宜的条件下，细胞具有发育成 完整植株的潜在能力。
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✓ 激素在细胞生长发育中具有重要的调控作用
✓ 离体培养器官分化，大都是通过外源激素而 实现的 ✓ 生长素与细胞分裂素在离体器官分化调控中 占有主导地位
三、植物细胞工程应用
(一) 药用植物育种方面的应用 获得特殊种质材料，缩短育种 周期； 快速获得特殊倍性材料； 克服远缘杂交不亲和、杂种胚 早期夭折； 导入外源基因； 种质资源保存种苗脱病毒与快 速繁殖。
紫草宁产生于亚洲的多 年 生 植 物 紫 草 (Arnebia euchroma)的根部。但紫草资 源严重不足，在日本，紫草 已濒临灭绝，在我国紫草列 入了二级保护植物。
野生新疆雪莲治疗妇科疾病、风湿性关节炎等有显 著疗效；可防紫外辐射、延缓衰老、抑制癌细胞增长等。
对雪莲愈伤组织反应器悬浮培养生产次级代谢产物进行研究
产品成分 用途
年销售额(亿美元)
长春花碱 治疗白血病 18～20 (美国)
阿吗灵 循环系统障碍 5～25 (全世界)
奎宁
治疗疟疾
5～10 (美国)
致热素 杀虫剂
20 (全世界)
毛地黄 心脏病
20～55 (美国)
2、植物次生代谢产物在医药、食品、轻工业等领 域具有重要意义 • 优良的食品添加剂和名贵化妆品原料； • 生物毒素的主要来源，用于杀虫、杀菌，而对环 境和人畜无害，是理想的环保产品。 3、规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途 径
(三) 培养系统
1、悬浮培养系统 2、机械搅拌式培养系统 在微生物发酵罐的基础上改进设计：搅拌装置改叶轮式为 螺旋式减少剪切；植物细胞生长周期长，设计加液装置； 设有通气装置满足植物细胞生理活动需要的新鲜空气和排 出细胞代谢产生的有害气体；设计有取样口便于取样。 3、气压搅拌式培养系统 降低机械搅拌式剪切，减少转动轴对培养物的污染，缺点 是搅拌不均匀。 4、旋转式培养系统 用于产品中试或必需裂解细胞获得目的产物的培养。优点 是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。
紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁 的无法满足市场需求。
化学合成紫草宁的工艺非常复杂，且最终产率只 有0.7%，生产成本昂贵。
紫草宁在国际市场上售价高达7000美元/kg
植物体和细胞培养紫草宁含量(%干重)比较
生产方式 生产周期 含量
完整植株 2～3年 1～2
植物细胞培养 3周
14
7
长春花细胞培养生产生物碱，青蒿细胞生产青蒿 素，喜树细胞生产喜树碱，苦瓜细胞培养生产胰岛素， 三七细胞培养生产皂甙和丹参细胞培养生产丹参酮等。
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(二) 植物细胞或组织培养条件
光照：光照强度、光质、光照时间 湿度：培养容器内湿度(几乎100%)，环境湿度(70～80%) pH值：通常pH值范围是5.5～6.5，pH4.0以下或7.0以上 培养物不能正常生长 温度 渗透压 通气条件
有机化合物
糖类：C源、维持培养基的渗透压，植物组培常用蔗糖 维生素： 肌醇：促进糖类的相互转化和维生素、激素的利用，使 培养物快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响 腺嘌呤：是合成细胞分裂素的前体之一，外源添加腺嘌 呤有利于细胞协调自身合成细胞分裂素 氨基酸：常用水解酪蛋白、水解乳蛋白等多种氨基酸的 混合物
(二) 基本设备配置
冰箱3、液氮罐、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养 基分装器、搅拌器、振荡器、离心机 灭菌设备(蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装 置、喷雾消毒器、紫外灯) 无菌操作设备(净化工作台、接种箱) 光温控制设备(时间程序控制器、空调及温度感应器) 细胞培养设备(培养架、培养箱、摇床、生物反应器等) 细胞学鉴定设备(光学研究显微镜、实体显微镜、倒置 显微镜) 有条件可配制摄影设备、生化分析设备等。
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(四) 影响植物细胞培养及次生产物合成的因素
1、植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型：产物合成与细胞生长成正比 中间型：产物仅在细胞生长下降时合成 非生长偶联型：产物合成在细胞生长停止以后
2、影响因素 内因：细胞的遗传特性、母细胞外植体的生理状态 外因：温度、pH、营养状况、通气状况 生长调节因子：激素、前体物质
Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的 诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养 下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L。
清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培 养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技 术在2~3天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。
紫草宁可用作创伤、烧 伤以及痔疮的治疗药物，同 时又因为其漂亮的紫红色而 作为高级色素使用。
一、实验室设置
细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备；无菌操作；控制培养 (一) 实验室组成：基本实验室、辅助实验室 1、基本实验室 准备室完成培养基配制、洗涤与灭菌等，要求宽敞明 亮，通风条件好。 接种室进行无菌操作，要求封闭性好、干燥清洁、能 较长时间保持无菌。房间不宜过大，接种室除了出入 口和通气口外，应行密闭。 培养室是对离体材料进行控制培养。首要要求是要能 控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应 保持干燥和清洁。
二、植物细胞培养技术建立阶段
植物组织培养建立了两个与培养技术有关的 重要模式：培养基模式和激素调控模式。
(一) 植物组织或细胞培养方式
1、外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长 发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。 2、悬浮细胞培养：产业化大规模细胞培养，制取植物代谢 产物。 3、原生质体培养：培养脱壁后的细胞：①比较容易摄取外 来的遗传物质；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③ 适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 4、单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。
紫杉醇存在于红豆 杉 属 植 物 的树 皮 、 叶 及 茎 中 ， 其 中树 皮 中 的 含 量最高，大约从12000株 成 年 紫 杉 树中 才 能 提 取 1Kg的紫杉醇，而且紫杉 的 生 长 周 期很 长 ， 在 世 界 分 布 很 少。 紫 杉 醇 国 际市场价格450美元/g
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日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，紫 杉醇的含量达到了0.05%，比树皮中紫杉醇的含量高 达10倍。
(三) 离体培养的营养需求
植物离体培养基至少包括无机盐、有机化合物、 生长调节剂，根据不同需要附加其它成分。
无机盐类
• 参与机体的建造 • 构成特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶 的活化剂 • 维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等 • 在发育过程中，影响组织器官的建成