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同时一种成分的色谱行为会受到混合物中其他 成分的影响，这种影响的大小取决于混合成分 的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影 响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后 面的一个展开速度较其单独展开时为大。
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固定相的活度及其调节
在其他因素一定时，活度增加，Rf值减少， 反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其 表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿 度恒定的空间里来达到调节活度的目的。
许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致， 导致实验难以重现。
溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注 意出厂日期。
混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相 互作用。
对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流 动相。要求操作格外小心，同时混合流动相 不应重复使用。
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溶剂的选择性
指溶剂引起两种溶质位移差别的能力，即 分离度。
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薄层色谱与高效液相色谱的差别（特点）
固定相和流动相
TLC——流动相流动靠毛细作用力， 流动相选择较少受限制。而 HPLC是 在封闭的系统内，流动相流量靠泵控 制，溶剂选择受检测器限制。
样品处理
TLC要求没有HPLC严格。
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色谱分离
TLC可同时分离多个样品，并可采用相同 或不同溶剂进行同向或双相多次展开，通 常采用正相色谱。
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R=
n
× ⊿Rf
4
Rf1
由上式，Rf与R之间存在着如图所示关系
R
Rf=0.3,R最高
1.00
Rf在0.2-0.5,R变化不大
0.75
Rf﹤0.1或﹥0.7,R下降
0.5
0.25
0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 Rf1
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4 流动相与展开体系
液-固吸附 ——在该色谱中，溶质的保留 和分离选择性决定于三个因素：
自动薄层色谱点样仪——由计算机控制。
药典规定：点样基线距底边2.0cm, 样点直径 2-4mm, 点间距离约为1.5-2.0cm。
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展开方式
多数采用直线形上行展开，薄层板水平 角度以75 为最佳。展开距离一般为1015cm。
多次展开——一次展开未达满意分离时， 可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展 开，可重复多次，直到混合物分离为止。
含有荧光指示剂的商品吸附剂以“F”表示， 并以下标注明其激发光波长。例 硅胶HF254
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薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起 的凹坑和龟裂。例：
硅胶板（粒度10 ～40um）
硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水， 研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比 例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅 速研磨均匀，立即涂铺。
HPLC一通常采用反相色谱。
对污染物抗受力强
TLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不 可逆吸附物质均无影响。
HPLC—— 颗粒物质、腐蚀性物质、 不可逆吸附物质均有大的影响。
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2 薄层色谱系统
薄层板 未改性固定相 硅胶—为使用最广泛的薄层材料 氧化铝—有碱性、中性、酸性 硅藻土—为化学中性吸附剂 纤维素—天然多糖类 聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料， 对能形成氢键的物质有特别的选择性。
点样量应适中，过载会引起斑点拖尾， 分离度变差，以最小检测量的几倍～几 十倍为宜。
手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 – 5ul），微量注射器。
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自动点样
Limomat IV 喷样仪——样品溶液通过气流 成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上 流下样品条带。
• 特点：适合于大量稀样品溶液的喷加； 条带宽度不超过2mm，有利于改善分 辨率；便于狭缝式光密度计扫描；要 求薄层板强度高。
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表面改性固定相
疏水改性硅胶——化学键合烷基
亲水改性硅胶——引入氨基、氰基、二 羟基等，薄层板极性介于极性吸附剂和 疏水改性剂之间（极性次序：硅胶﹥氨 基﹥氰基﹥二羟基﹥ 反相）。
表面改性纤维素——乙酰化纤维素
药典收载的固定相有：硅胶类、硅藻土类、 氧化铝类、微晶纤维素类等。颗粒直径一 般要求10 – 40 um。
R=1/4（ -1） n[k /（ k +1）] 分离因子= k1/k2，k为k1和k2的平均值 由上式可见，R取决于三个因子：
理论塔片n主要是吸附剂性质的函数 k 反映了两种溶质的平均迁移速度，
其由流动相溶剂强度 决定 取决于吸附剂和流动相的组成
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溶剂优化规则：
薄层色谱法
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1概述
▪ 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一 种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色 谱法”一书，推动了这一技术的发展。
▪ 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率 高，结果直观，很快被用作定性和半定量的 方法。
70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代 以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步 操作的仪器化，并实现了计算机化。
物理方法——紫外光下显示荧光或荧光淬灭
化学方法——加化学试剂显色，要求显色稳定、 持久、专属、灵敏、线性良好。
斑点定位方法
碘蒸气法——灵敏、简便，为通用显色法。将 碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸 内充满紫色的碘蒸气。将展开后的板挥干溶剂 置碘缸中至薄层色谱上出现棕色斑点。放置时 间不宜太长，否则背景吸附剂也吸附碘，使信 噪比降低。用针头将斑点标记下来，放在通风 处使碘挥发。
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有机黏结剂——羧甲基纤维素钠(CMC）、 淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特 点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓 硫酸作显色剂。
荧光黏结剂——在吸附剂中添加某种荧光指 示剂，常用的荧光指示剂
在254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光 素、硫化镉、阴极绿等。
在366nm有荧光的指示剂如彩蓝等。
流动相
溶 解 能 力
竞争
吸附 剂
溶质 相互作用
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液-液分配
基于组分在互不相溶的两相间的溶解度 不同而实现分离的一种展开系统。可在 展开前，将薄层板浸入某种液体固定相。 实际上在TLC中，分配与吸附是并存的 （大气中水分也是一种固定相）。
此外还有：化学键合相反相展开、化学 键合相正相展开、离子交换、离子对色 谱、凝胶、胶束、手性展开。
b0.5为样品斑点半峰宽， b0样品起始斑点 半峰宽。
塔片高度h真实= Ls/ n真实
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容量因子（k）与比移值（Rf） k=ts/ tm（物质在两相中滞留时间之比） 又k=K（Vs/ Vm） Rf=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k） k ∞ 9 4 2 1 0.5 0
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3 薄层色谱参数
保留参数（Rf值）
用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，
通常称作比移值，用Rf表示。
Rf=LL。s/L。，
样品
Lr
原
W
点
原 点
参 比
前 沿
RS
Ls
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注意：
同一物质在不同展开方式中得到的比移 值是不相同的。
在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比 移值(Rf)n=1-(1-Rf)n 。
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一些常用溶剂的溶剂强度与溶解度参数
溶剂
溶剂
正己烷 0.01 7.3 环己烷 0.04 8.2
苯
0.32 9.2 乙醚 0.38 7.4
二氯甲烷 0.42 9.6 正丙醇 0.82 10.2
正丁醇 0.70 /
四氢呋喃 0.57 9.1
乙酸乙甲乙酮 0.51 /
二氧六环 0.56 9.8
吡啶
0.71 10.4 丙酮
0.50 9.4
乙醇
0.88 /
乙酸 1.00 12.4
二甲亚砜 0.75 12.8 甲醇
0.95 12.9
乙二醇 1.11 14.7 甲酰胺 / 17.9
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流动相选择时需考虑溶剂的下列情况
一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作 保护剂，有时需重蒸除去乙醇。
分步展开——混合物性质差别较大时， 一种流动相不能有效分离时，可采用不 同溶剂依次展开不同距离。
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连续展开——使到达薄层上缘的溶剂不断蒸 发，连续展开以增加展开距离。因无溶剂前 沿，需要有个参照物同时展开，以计算相对 保留值。
二维展开——在两个垂直的方向上进行展开。 将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距 离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方 向成90 的方向进行展开。
也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元 混合流动相，此时，溶剂强度由弱溶剂控制， 而溶剂选择性则由两强溶剂控制。
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斑点的扩散与形状
在TLC中斑点的移动与扩散是二维的，因为 斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速 度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等 的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶 剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶 剂前沿时为零，这一现象称为“溶剂的体积 梯度”，在各种展开形式中均存在。当然， 对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时 才需要考虑。
硅胶
110℃
1h
氧化铝
110℃
30min
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比纸色谱具有速度快、分离清晰、灵敏度高、可 以采用各种方法显色等特点。