SHMT基因工程菌的构建
第四组
一、实验相关知识
1、丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶，能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化，具体的催化反应如下：
SHMT
甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸+四氢叶酸
在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）作用下，甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。

该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。

N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸，它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。

本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关，但由于SHMT的催化作用理论上是双向的，有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。

2、基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。

所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。

它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

它克服了远缘杂交的不亲和障碍。

3、丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。

丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。

[大肠杆菌] 细菌染色体DNA 的制备（预习方案）一．实训目的
.学习并掌握细菌基因组的基本知识和提取方法
二．实训原理及相关知识
1.大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小
0.5×1～3微米。

周身鞭毛，能运动，无芽孢。

能发酵多种糖
类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后
即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几占粪便干重的1/3。

国
家规定，每升饮用水肠杆菌数不应超过3个大肠杆菌的抗原成
分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。

2.大肠杆菌常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎等等。

侵入人体
一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。

人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。

感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。

3.大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，
只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。

大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。

4.大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的
宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。

目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。

5.核酸：
6.
7.基因组是指细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总
和，或原核生物染色体、质粒、真核生物的单倍染色体组、细胞器、病毒中所含有的一整套基因。

8.[实训原理]提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十
二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物
质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇
或异丙醇而除去。

三．实训试剂
LB液体培养基，LB固体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl，CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇
四．仪器设备
超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、循环水真空泵、电子天平、冰箱、精密pH试纸、微量移液器、离心管、试剂平、tip头、吸水纸、标签纸、记号笔等。

五．实训步骤
1.菌种培养
固体培养基：从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种，接种到
一只新鲜的LB固体平板上，倒置在恒温培养箱中，37度培养
16~18h。

液体培养基：从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种，接种到
一只装有5ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，置于恒温摇床
中，37度振荡培养过夜。

2.试剂的配置
（1）、LB液体培养基：蛋白胨1.0g ，酵母膏0.5g ，NaCl1.0g ，加蒸馏水使之充分溶解，滴加5mol/ LNaOH调pH至7.0 ，
补足水分至100ml，121度高压蒸汽灭菌20min，冷却待用。

（2）、LB固体培养基：蛋白胨1.0g ，酵母膏0.5g ，NaCl1.0g ，加蒸馏水使之充分溶解，再加琼脂粉1.5g ，加热融化，补足水分至100ml，调pH至7.0 ，121度高压蒸汽灭菌20min，冷却待用。

（3）TE溶液：实验室所用的TE缓冲液是终浓度分别为10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和1mmol/L EDTA(Ph8.0)的混合液。

（4）10%SDS：称取10.0g SDS 慢慢转移到约含80ml水的烧杯中，用磁力搅拌器或加热至68度助溶，搅拌至完全溶解，用水定容至100ml 。

（5）蛋白酶K：将200mg蛋白酶K加入到8.0ml无菌双蒸水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。

不要漩涡混合，加水定容到10ml，不需灭菌分装成小分，储存于-20度。

（6）5mol/L NaCl：在80ml蒸馏水中溶解29.22g NaCl，加水定容至100ml，分装后高压灭菌。

（7）CTAB/NaCl溶液：称取4.1g NaCl溶解于80ml蒸馏水中，缓慢加入10g CTAB ，可加热至65度溶解，定容至100mL。

（8）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按1：1的比例混合用Tris 饱和的酚与氯仿/异戊醇（24：1）。

（9）其他试剂：异丙醇，70%乙醇等。

3.制备细菌基因组
（1）菌体收集：将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌
液5000rpm冷冻离心10min弃上清；
（2）加190μL TE悬浮沉淀，并加10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；
（3）加30μL 5mol/L NaCl，混匀；
（4）加30μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；
（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm 离心10min，将上清液移至干净离心管；
（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中；
（7）加300μL异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；
（8）5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500μL70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，吸干；
（9）溶解于20μLTE，取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20℃保存。

六、实训注意事项
1.称量时严防试剂混杂，一把牛角匙用于一种试剂（或称取一种试剂后，洗净、擦干，再称取另一种试剂。

）瓶盖不要盖错，及时贴上标签。

2. 酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。

所有操作应在化学通风橱中进行。

与酚接触过的皮肤应立即用大量的水清洗，忌用乙醇。

3.SDS的微细晶粒易扩，因此称量时要带面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS。

10%的SDS溶液无需灭菌。

SDS 在低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

4.染色体DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力作用容易断裂，所以操作时要注意避免。