布鲁氏菌病诊断方法的研究进展吴星星 1，李爱巧 1，杨启元 1，李建玲 1，张 婕 1，王清平 1，王 涛 1，王 璐 1，钟 旗 2， 古文喜 2（1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆 乌鲁木齐 830063；2.新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）摘要：布鲁氏菌病已成为世界性公共卫生问题，其疫情在人、畜间逐年上升。
不仅对人类健康构成威胁，而且严重影响我国现代畜牧业经济的快速发展。
因此，及早发现、准确、快速地检测该病具有重要意义，本文就动物布鲁氏菌病诊断方法做一简要概述，为今后布病诊断新方法的研究和现有方法的选择运用提供参考，以便更有效地防控该病发生。
关键词：布鲁氏菌病；诊断方法；公共卫生中图分类号：S858.2 文献标识码：B文章编号：1003-4889(2013)01-0016-05布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病，家畜中牛、羊、猪最常发生，且可感染人，在我国，布病广泛流行，尤其是以畜牧业为主的地区。
据统计，截至2009年，全国有29个省（区、市）发生人畜间布病，牛、羊、猪感染达百万头之多，人的布病亦呈上升趋势，2009年全年新增人布病3.7万例[1]。
世界范围内，每年出现约50万例人布病[2]。
该病危害较大，可引起母畜流产、奶牛乳房炎、公畜不育等病症，影响产仔率和产奶量，使畜牧业和养殖户的经济利益严重受损；在我国进出口贸易中，牲畜和其产品占据重要地位，但此病的流行，阻碍了我国外贸业的发展。
据1993年报导，我国出口到日本的13峰骆驼，因布病检测阳性被拒绝引进[3]；布病感染人传播途径较多，消化道、皮肤、黏膜伤口是主要途径，通过食用病畜乳肉制品可发生感染，屠宰工、饲养人员、兽医、动物产品加工者等职业者可通过直接接触感染，是兽医人员的职业病；另外，污染的水源、收稿日期：2012-11-12基金项目：乌鲁木齐市科技局人才工程专项（P101210003）。
作者简介：吴星星（1986- ）,女,汉族,硕士研究生,主要从 事动物疫病监测工作。
土壤、吸血昆虫均可造成间接感染。
患者主要表现为发热、寒颤、盗汗、关节痛等且反复发作，难以治愈，久病者可丧失劳动能力，严重者则造成死亡[4]，对人类健康和生活构成了巨大威胁，在社会公共卫生上具有重要的意义。
布鲁氏菌分6个种19个生物型，由于各型间流行特点及免疫原性的差异，加之人工免疫与交叉抗体等因素的影响，所以建立布病快速、准确的诊断方法一直是国内外学者的研究热点。
目前，布病的诊断方法包括病原学诊断、血清学诊断和现代分子生物学诊断技术。
1 病原学诊断1.1 布鲁氏菌的分离培养细菌分离培养是病原学诊断的传统方法。
通常采取流产胎儿的胃内容物、肺、肝和脾以及流产胎盘和羊水进行布鲁氏菌的分离培养。
该菌对营养条件要求较高，普通培养基上较难生长，必需添加血清或马铃薯浸液等成分，生长繁殖缓慢，初代分离需1~2周，长者达20~30d，布鲁氏菌牛种和绵羊附睾中的某些生物型初次分离时还需要5%~10%CO2。
菌落生长形态呈圆形、稍隆起，边缘整齐、光滑湿润、大小为0.5 ~1.0mm，在血琼脂上生长为白色，且不溶血，在马铃薯琼脂斜面上，长出水溶性微棕色菌苔。
1.2 布鲁氏菌的染色与镜检培养菌落经涂片镜检观察，布鲁氏菌为小球杆状或短杆状，多呈散在分布，偶见成对、短链状或串状排列。
边缘稍圆或直，无芽孢及鞭毛，但在条件不利时具有形成荚膜的能力。
革兰氏染色为红色；姬姆萨染色呈紫色；改良Ziehl-Neelsen 氏法染色显红色，背景为蓝色；改良 Koster 氏法染色显红色，背景为蓝色；柯兹洛夫斯基法染色显红色，其他细菌呈现绿色。
1.3 生化试验鉴定获得布鲁氏菌分离株后，需对其进行一系列的表型研究。
传统种型鉴别方法有：根据生物化学特征（细菌生长是否需要CO2、是否产生H2S、各种细胞代谢酶类的活性检测）、血清学特征（A、M、R因子血清凝集试验）、噬菌体和细菌素裂解被检细菌所形成裂解谱的判定、药物敏感试验等。
不同布鲁氏菌种及生物型之间抗原特性差别较小，分型过程繁杂且易造成实验室感染，主观因素影响较大。
因此，从基因水平上建立布鲁氏杆菌分型标准可能得出更为科学的结论。
2 血清学诊断技术2.1 凝集实验2.1.1 全乳环状试验（MRT）全乳环状试验（MRT）主要用于乳样的布病筛查，操作简单快速适合现场应用，但大规模监测时可靠性差，且对羊种布鲁氏菌敏感性低。
在检测牛初乳、干奶期接近的奶牛、发情旺盛期奶牛、乳房炎患牛、免疫疫苗后不到４个月的牛乳样时，均可能出现假阳性结果[5]。
2.1.2 虎红平板凝集试验（RBPT）RBPT抗原是将布鲁氏菌菌株（抗原性良好）经培养、灭活、离心后收集菌体用虎红染料染色后悬于乳酸缓冲液中制成，与被检血清在洁净的玻璃板上进行凝集反应，若出现沙粒状凝集者则判为阳性。
该方法操作简易、检测快速，成本低廉，但准确性易受温度和凝集时间的影响，且抗原的标准化也可影响其敏感性[6]，有时会因牛种布鲁氏菌S19弱毒疫苗免疫和交叉反应造成假阳性结果，偶尔会因前带现象出现假阴性结果[7] ，故RBPT适于动物布病的普查，目前，在国际贸易中仍用于牛、羊、猪布病检测，在我国也用于人布病监测的初筛。
2.1.3 试管凝集试验（SAT）SAT由Wrigh于1987年建立，可以定量，因而在判定反应强度上比虎红平板凝集试验更精确。
1998年，我国将其列入国标作为诊断布病的正式法定试验并沿用至今。
该实验操作步骤繁琐，需37℃条件下孵育过夜，较费时，不适于现场检疫和基层采用，家畜感染（自然感染或人工免疫）布病一定时间后，机体中先后产生IgM与IgG两种抗体，而SAT检测IgM敏感性较高，因此可用于布病早期诊断，且对人畜布病疫苗免疫后血清抗体也能检测[8]，但不适合绵羊种布病的诊断。
单独应用会造成误诊和漏诊，因为不是所有感染动物所处的抗体水平都具有诊断意义。
同RBPT一样，SAT也不能鉴别人工免疫和自然感染动物。
上述常规血清学方法均是基于抗体对布鲁氏菌脂多糖O链抗原的检测，而布鲁氏菌脂多糖O链抗原可以和结肠炎耶尔森氏菌（O：9）、大肠杆菌（O：157）等阴性菌抗原以及小牛胸腺DNA发生交叉反应，故都有假阳性结果产生[9]。
研究表明：若将抗原血清混合液的pH值降低到3~4，可大大降低非特异性凝集，而不影响感染血清的凝集[10]。
2.2 补体结合试验补体结合试验（C F T）是世界动物卫生组织（OIE）公认的布病确诊性试验。
相比SAT和RBPT，特异性和敏感性较高[11]，具有较高的临床诊断价值，对于慢性布鲁氏菌病，RBPT检测为阴性，而CFT检测为阳性，且在检测成年牛（未经免疫或犊牛时给予免疫的）时非常准确[3]。
主要应用于牛、羊、绵羊附睾种布氏杆菌病的诊断，但不适合猪个体布病的诊断，因为豚鼠补体会受到猪补体的干扰，使实验敏感性降低38%~40%[12，13]，发生溶血的样品，也不能用CFT检测，另外，实验参与反应成分多，需设立多组对照，结果判定主要通过肉眼观察溶液颜色的深浅判定出溶血程度，所以结论主观性强，易产生误差。
而且实验要求条件高，操作复杂，基层检疫难以采用。
靖吉强[14]等将低速离心技术应用于CFT中，通过比较样品离心管和红细胞对照管红细胞沉淀的多少来判定结果发现：经过改进，主观因素对实验结果的影响程度明显降低。
2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA分为间接ELISA（i-ELISA）和竞争E L I S A（C-E L I S A），可用于血清及乳汁样本布病的检测，i-ELISA是以光滑型布鲁氏菌菌体脂多糖（S-LPS）作包被抗原，主要检测IgGs或IgG亚型，在美国、加拿大、瑞典等国家已有商品化的检测试剂盒问世，国内也有类似研究。
Kittelberger 指出i-ELISA敏感性高，优于上述其他血清学方法[15]，但在实际应用中仍存在血清交叉问题，难以区分人工免疫和自然感染。
因此主要用作布病的筛查，为解决面临的问题，Nielsen[16]建立了C-ELISA方法，即在ELISA微孔上包被光滑型布鲁氏菌菌体脂多糖（S-LPS），加入O型多糖（OPS）表位之一的特异单克隆抗体，再加入稀释被检血清，洗涤，加入酶标抗鼠IgG辣根过氧化物酶的复合物。
Weynants V等在1996年制备了2株辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，用辣根过氧化物酶其检测牛血清表明：该方法较敏感，无假阴性结果出现，且能较好的区分人工免疫和自然感染[17]。
敏感性与i-ELISA相当，但大于缓冲平板凝集试验（BPAT）。
在检测未免疫动物和假阳性样品时，特异性高于或等于i-ELISA，为此，2004年，C-ELISA被OIE列为诊断和清除牛布鲁氏菌病的推荐方法[9]。
3 分子生物学诊断自1985年美国Mullis等建立聚合酶链式反应（PCR）以来，以其为代表的分子生物学技术便迅速发展和普及开来，并广泛应用于微量DNA的研究。
20世纪90年代以来，PCR方法在布病研究中的应用日益增多，各国学者纷纷建立起多种PCR方法用以鉴定布鲁氏菌的属、种及生物型。
3.1 布鲁氏菌属鉴定的PCR方法Mayfield等和Herman等[18]分别以BCSP31、16srRNA为靶基因建立了常规PCR诊断方法得出：在所有布鲁氏菌种和生物型中，BCSP31基因十分保守，对疫苗株、代表菌株、分离野毒株均存在特异性扩增，对存在血清学交叉或进化关联大的细菌扩增呈阴性，表明可利用BCSP31和16srRNA 从属的水平鉴定布鲁氏菌；国内杜振昆等[19]建立了以165rRNA为靶基因的套式PCR以乳样为检测品，得出与Herman相一致的结论，除此之外，omp2和VirB8基因也可用做菌属鉴定[20，21]。
后来E.Navarro 等[22]针对BCSP31、16srRNA和omp2三种靶基因PCR 的敏感性进行比较实验得出：三者检测灵敏度在8 fg-20 fg DNA、omp2 PCR不会受人类DNA的干扰，而BCSP31、16srRNA PCR则相反，但16 SrNA PCR 方法是最敏感的。
3.2 布鲁氏菌种、型鉴定的PCR方法Bricker等根据不同种布鲁氏菌基因组中插入序列IS711在数量及位置上的差异建立了AMOS-PCR （Abortus Melitensis Ovis Suis-PCR），可区分布鲁氏菌牛种（1、2、4型）、羊种（1、2、3型）、猪种（1型）、绵羊附睾种，能鉴别牛种布鲁氏菌S19和RB51（粗糙型突变菌株）疫苗[23，24]，后经Ewalt等[25]证实：该方法准确率达100%。
2008年，国内钟旗等[26]研究发现：AMOS-PCR还可鉴定犬布鲁氏菌，区分S19疫苗株和野毒株。