[作者简介] 欧阳燕玲(1967-),女,学士,副主任检验师,主要
从事理化检验工作。
【化学测定方法】
高效液相色谱法检测葡萄酒中5种人工合成色素方法的探讨
欧阳燕玲,谢维平,陈春祝
(福建省泉州市卫生防疫站,福建泉州 362000)
[摘要] 目的:建立葡萄酒中5种人工合成色素H PLC 检测新方法。
方法:采用梯度洗脱,利用每种色素最大可见吸收
波长,在检测过程中变化波长测定各色素。
结果:本法R SD 为2183%~3198%,回收率95%~99%。
结论:用于大批量的葡萄酒样测定,其干扰小,灵敏度高,线性范围好,精密度和准确度良好,结果满意。
[关键词] 高效液相色谱法;葡萄酒;人工合成色素;梯度洗脱;最大可见吸收波长
[中图分类号] O 65717+2 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2005)10-1218-02 近年来,高效液相色谱法(H PLC)是测定人工合成色素的首选方法之一,我们在国标的基础上简化了前处理步骤,建立了一种适用于葡萄酒基质测定人工合成色素的H PLC 方法,用甲醇-醋酸铵缓冲溶液为流动相进行梯度洗脱,充分利用每种色素最大可见吸收波长,在检测过程中变化波长测定各色素,避免了国标中采用单一波长254n m [1]繁琐的前处理,减少了提取过程的损失。
1 材料与方法
111 仪器与试剂
Beck m an125高效液相色谱仪带二极管阵列检测器(Beck -m an 公司,美国);色谱工作站:32K arat510;超声波清洗器;UU p w -25N 超纯水系统;微量进样器。
标准工作液为国家标准物质稀释而成;醋酸铵(HPLC 级);甲醇(HPLC 级);实验用水为超纯水。
112 高效液相色谱条件
色谱柱为Sy mme try shield R P18反相色谱柱(416mm @250mm @5L m );流动相采用0105m o l/L 醋酸铵A -甲醇B ;根据每种人工合成色素最大可见吸收波长考虑选择变化波长进行检测;梯度洗脱条件(见表1);流速112m l/m i n ;进样量10L ;l 柱温30e ;光谱采集210~600nm 。
表1 梯度洗脱条件时间(m i n )
流动相
A(%)
B(%)时间(m in)
波长(n m )
010881210105842111029813152981410
88
12
01043081049811154081410
430
113 标准系列及样品测定
将柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮兰各贮备液稀释配制成标准混合液,混合标准溶液的浓度分别为:1100、5100、10100、25100、50100、100100m g /L 。
将样品调节p H =6~7左
右(用柠檬酸或稀氨水)[2],超声波脱气。
分别取上述标准液、样品液各10L ,l 经0145L m 针筒式滤膜过滤,微量注射器进
样,注入H PLC ,起动时间程序,每组分均在最大可见吸收波长下检测,按保留时间和光谱图定性,峰面积定量,以峰面积对浓度作图,计算回归方程,外标法定量。
分析运行14m i n ,平衡14m i n 。
2 结果与讨论211 流动相的选择
经试验采用梯度洗脱,在10m i n 甲醇从12%递增到42%,以3%/m in 增加,之后在1m i n 内由42%递增至98%,以98%继续洗脱215m i n 。
通过调整流动相比例,各峰分离完全,且峰形良好,保留时间稳定。
各色素混合标准溶液(5010mg /L )的色谱图如图1所示。
图1 柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮兰
标准溶液(5010m g /L)色谱图
11柠檬黄;21苋菜红;31胭脂红;41日落黄;51亮兰
212 HPLC 测定波长的选择
采用二极管阵列检测器,可以实现多个波长变化检测,用二极管阵列检测器采集210~600n m 光谱图,各色素最大可见吸收波长:柠檬黄430n m,苋菜红520n m,胭脂红510n m,日落黄490n m,亮兰408n m (210~600n m )。
由此来相应采用具体测定波长,0~8m in 是柠檬黄出峰,本文用430n m,8m i n 后出峰顺序是苋菜红、胭脂红、日落黄,综合考虑苋菜红、胭脂红、日落黄最大可见吸收波长,选用498n m,适合这3种色素,3种色素在此波长均有较大灵敏度,1115m i n 后改用408n m,它是亮兰600nm 内灵敏度最高的波长。
采用254n m 和430n m 通道的一实际样品和样品加标测定色谱图如图2所示,由图2可见430n m 波长杂质峰明显变少,干扰变小,谱图清晰,可避免因干扰峰存在而掩盖样品色素峰。
国标中采用单
一波长254n m 检测,在此波长下很多化学组分均有吸收,造成大量的干扰峰,一些色素峰难以从干扰峰中辨别出。
采用每一组分的可见最大吸收波长进行检测可避免此缺陷,无颜色成分不会吸收,增加了灵敏度,
前处理也随之大大简化。
图2a 采用本法通道430n m 测定一实际样品的色谱图
11柠檬黄;21
苋菜红
图2b 采用通道254n m 测定一实际样品的色谱图
11柠檬黄;21
苋菜红
图2c 采用本法通道430n m 测定一实际样品加标的色谱图11柠檬黄;21苋菜红;31胭脂红;41日落黄;51
亮兰
图2d 采用通道254n m 测定一实际样品加标的色谱图11柠檬黄;21苋菜红;31胭脂红;41日落黄;51亮兰
213 光谱定性
由于采用二极管阵列检测器,可以采集210~600n m 光谱图,利用其光谱信息、光谱匹配度对色谱峰进行可靠的定性,避免了仅靠保留时间定性所引起的错误,本实验选用310~600nm ,避开了受杂质影响大的254n m 以下波长。
在较低
浓度(1100mg /L )仍有较好的光谱匹配度,这也才使前处理的简化成为可能。
214 方法的线性范围和检出限
在110~100100m g /L 范围内响应值与人工合成色素浓度呈良好线性关系,以Y 表示浓度,X 表示峰面积,回归方程为:柠檬黄Y =3452218X +9823145,相关系数r =019996;苋菜红Y =2092913X +5503121,r =019998;胭脂红Y =2312715X +1772212,r =019996;日落黄Y =2227713X +1058316,r =019999;亮兰Y =7062117X +2969162,r =019995。
6种标准曲线相关系数在019995~019999。
根据信噪比S /N =3计算检出限,柠檬黄01021m g /L,苋菜红01062mg /L,胭脂红01050mg /L,日落黄01048mg /L,亮兰0112mg /L 。
215 精密度试验
取一葡萄酒样品加标(50m g /L),按上述方法进行重复测定(n =6),计算精密度,其相对标准偏差(RSD )分别为:柠檬黄3101%,苋菜红3140%,胭脂红2183%,日落黄3146%,亮兰3198%。
216 加标回收率试验
加入高(8010mg /L )、低(1010mg /L )含量标准,按本法测定,计算回收率在95%~99%之间,符合方法学要求(见表2)。
表2 加标回收试验结果(n =3)
项目
本底值(m g /L)加标量(m g/L )测定值(mg /L)回收率(%)柠檬黄
9181010191196158010
87159714苋菜红1216101021199619801091119814胭脂红01010109179710801079129910日落黄01010109169610801079119819亮兰
010
101091595108010
7617
9519
217 方法的实际应用及样品测定结果
采用本方法对我市大批量的葡萄酒抽样测定,其干扰小,灵敏度高,测定结果表明,与国标法结果基本一致,无显著性差异。
3 小结
采用本方法梯度洗脱,变化波长测定葡萄酒中色素,充分利用各色素最大可见吸收波长,灵敏度高,受杂质峰干扰小的特点,样品峰得到很好的分离,预处理步骤简单,损失少,方法
稳定,线性范围好,精密度和准确度均获得满意的结果,能满足葡萄酒样的分析要求,很有实际应用价值。
[参考文献]
[1]GB /T5009135-20031食品卫生检验方法#理化部分(一)[S ]1[2]谷岩,曲明1高效液相色谱法测定饮料的食用色素[J]1化学分析
量,2004,13(1):42-431
(收稿日期:2005-06-16)。