高效液相色谱方法的验证
•方法验证的目的
•方法验证的内容
•方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的
目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。

方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。

同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。

方法验证的内容
•准确度
•精密度
•专属性
•检测限
•定量限
•线性和范围
•耐用性
准确度
定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。

一般用回收率%表示。

1. 主成分含量测定
原料药：对照品或方法比对
2. 制剂、中药：标准加样回收
杂质定量
测定：加样回收（n
³
9）
杂质对照品
方法比对
回收率
C-A
%=´
B
100%
杂质与主成分的相对含量
A:试验供试品中被测成分的量
（通常为含量测定量的50%）
B: 试验供试品中加入的对照品的量
（通常为±20%）
C:试验测定值
精密度
定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差
1. 重复性（n 9）
³
2. 中间精密度
3. 重复性
测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度，
分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。

同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。

专属性
定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。

1. 鉴别反应
2. 含量测定
杂质测定
测定：
限量检查
空白制剂，模拟复方
加速破坏试样测试
DAD峰纯度检查
检测限和定量限
检测限（LOD）：供试品中被测物能被检测出的最低量。

通常采用信噪比3:1或2:1
定量限（LOQ）: 供试品中被测物能被定量测定的最低量。

通常采用信噪比10:1
S
N=
h
P h
baselinenoise
测定：将一对照品储备溶液，逐步稀释，分别进样分析，计算相应
色谱峰高h和平均基线噪音（h
p
）之比。

通常报告进样质量baseline noise
或进样体积（需与样品制备方法相关）。

线性和范围
线性：在设计范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

范围：在能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

测定：至少5个浓度（n5），每个浓度进样3次，以3次进样的平均
峰面积对样品浓度进行线性回归。

³
耐用性
定义：在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。

测定：
供试品溶液的稳定性（溶剂，温度，时间等）
进样量
流动相组成比例，pH
不同牌号的同类型色谱柱，柱温，流速
检测波长（最大吸收波长位移范围，及吸收强度的变化等）
分析方法研究和验证中使用的标准物质
•对照品（一级标准）
•工作标准（二级标准）
•非法定对照品
杂质分析
新原料药和新制剂中的杂质研究
国家有关新药申报要求
仪器要求：
ICH文本：Q3A, Q3B
1.检测灵敏度：波长，灯
能量，流通池，进样量
等其它色谱条件
2.数据处理：积分参数•采用对照品，或相对保留时间定位
•采用D A D或MWD确定UV光谱或不同波长的检测情况
•测定对主成分的相对响应因子（0.9~1.1）。