荧光定量P C R 之绝对定量分析——标准曲线的绘制
1. 绝对定量定义
绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。

将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。

以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。

* Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系
*由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量
2. 绝对定量标准品
标准品的一些标准
* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同
*标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）
*在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值
标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA也可以是比扩增片段长的纯化
后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA甚至cDNA但前提是所有的作为标准品的核酸
都必须保证稳定。

3. 标准品的制备
一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的
准确性。

一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。

倍比梯度稀释方法：
1v 原液(标准品i ) +9v 稀释缓冲液，得标准品ii
1v 标准品ii+9v 稀释缓冲液，得标准品iii
1v 标准品iii+9v 稀释缓冲液，得标准品iv
1v 标准品iv+9v 稀释缓冲液，得标准品v
依次倍比稀释
拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算
4. 实例
标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700测得其拷贝数1.55 X 108copy /ul 标准曲线的绘制( 1cycle=1min )
设置对照：浓度为 1.55X107、1.55X106、1.55X105、1.55X104、1.55X103、1.55X102、1.55 X 101的标准样品各一个，设空白对照
PCF反应：以不同浓度标准品作为模板
标准品的扩增曲线
标准品的溶解曲线
标准品的标准曲线图
扩增效率(巳计算：
E=10"斜率=10-1/-3.23 =2.04 , E%=(2.04-1) X 100%=104%
若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：
即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7
4 7
Qua ntityu nkno w=10 =50118 copies
核酸拷贝数的计算
一、分步推理如何计算核酸拷贝数
1A260 吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml
核酸浓度=(OD260)X (dilution factor) X [33 或40 或50]=ng/ul
MW代表克/摩尔，单位dolton : Idolton 即表示1g/mol 1摩尔=6.02x1023摩尔分子(拷贝数)
平均分子量(MW) dsDNA=^基数)X (660道尔顿/碱基)
ssDNA = ( 碱基数)X (330 道尔顿/ 碱
ssRNA=(g基数)X (340道尔顿/碱基)
得到拷贝数计算公式：(6.02x10 23拷贝数/摩尔)X (浓度)/(MW g/mol)= copies/ml. 即(6.02x10 23) X (g/ml)/(DNA length X 660)=copies/ml.
或(6.02 X 1023) X (ng/ul X 10j/(DNA length X 660)=copies/ul.
例：3000碱基质粒，浓度100 ng/ul
MW=3000bp 660dalton/bp=1.98 X 106daltons，即1mol=1.98 X 106g
(100ng X 10-9)g/1.98 X 106=摩尔数
copy 数=摩尔数X 6.02 X 10 = 3X 10 copies/ul.
二、这是一个小小的计算器，使你计算更加方便快捷，免去算数之苦……
http://www.bioask.me/html/541.html
什么是拷贝数？/html/540.html
如何计算拷贝数?
计算方法：（6.02 x 1023拷贝数/摩尔）x （浓度g/ml）/ （MW g/mol） = copies/ml
［平均分子量（MW g/mol）: dsDNA=（碱基数）x （660道尔顿/碱基）;ssDNA=碱基数）x （330
道尔顿/碱基）;ssRNA=（碱基数）x （340道尔顿/碱基）］。