RDA技术原理和基本过程示意图
mRNA-DD技术原理和基本过程示意图
（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因
人类的部分疾病，已经有相应的动物模型。
如果动物某种表型的突变基因定位于染色体的 某一部位, 而具有相似人类疾病表型的基因很 有可能存在于人染色体的同源部位。 另外，当疾病基因在动物模型上已完成鉴 定，还可以采用荧光原位杂交来定位分离人的 同源基因。
（）
②CAPS（Cleaved amplified polymorphic sequence ）标记:
是特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种DNA标记,当 SCAR（sequence characterized amplified regions)或STS的特异 扩增产物的电泳谱带不表现多态性时，一种补救办法就是用限制性 内切酶对扩增产物进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙烯胺凝胶电 泳检测其多态性,这种多态性称为CAPS标记。它揭示的是特异PCR产 物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，也表现为限制性片段长度 的多态性。
（3）基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记
①AFLP（amplified fragments length polymorphism ） 标记:扩增片段长度多态性。通过对基因组DNA酶切片段的 选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。AFLP揭示 的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。
• RFLP连锁图 ♪ RFLP 作图的程序 与经典遗传作图类似,只是统计性状改为DNA 分子标记; 程序：选择已知基因型的亲本 → 设计杂交方案 → 获得交配的子代 → 分析其DNA分子标记
第三节：疾病基因鉴定
鉴定疾病相关基因的关键是确定疾病 表型和基因间的实质联系
正确的诊断是鉴定疾病基因的先决条件
v-l之间也是连锁的，其中重组配 子型为⑤、⑥、⑦、⑧，因此： Rfv-l＝(⑤＋⑥＋⑦＋⑧)/1011 ＝18.9%
⑧
vb+
总数
19
1011
因此v和b之间的重组频率最高，应当相距最远， l在v和b位点之间，用遗传图表示如下：
18.9 v l 25.6 b
由此可见，通过一次三因子杂交和测交分析， 不仅可以确定3个基因间的遗传距离，而且还可 以弄清楚它们在染色体上的排列顺序。
1 39
Recombinant s
39
(B)
9RFLP analysis of plants in F2 population with RG214
Fig.1 The southern analysis of RFLP marker RG214.
Байду номын сангаас
（2 ）基于PCR的DNA标记：
①RAPD（random amplified polymorphic DNA ）标记：
B
A. 基于DNA分子标记的一条
人类染色体上的（基因）连锁图
B. A
基于VNTR标记的人系谱分析图
• 遗传图谱(genetic map)：将基因在染色体上的相 对位置和距离描绘出来的图，又称为连锁遗传 图谱(linkage genetic map)。在遗传图谱上代表 一对等位基因的位置称为基因位点。
• 多点杂交
1. 三点杂交
VvBbLl × vvbbll
类型
① ② ③ ④
对于v-b这对基因之间的4种基因 型：
vb＝①＋⑧＝302＋19＝321
++＝②＋⑦＝298＋20＝318
F1配子基因型
vbl +++ +b+ v+l
数目
302 298 115 105
v+ ＝④＋⑥＝105＋72＝177 +b ＝③＋⑤＝115＋80＝195 四种基因型比例不符合1:1:1:1的 比例，因此v-b之间是连锁的。其 中③、④、⑤、⑥为重组配子类 型，因此： Rfv-b＝(③＋④＋⑤＋⑥)/1011
（4）单核苷酸多态性的DNA标记
SNP（single nucleotide polymorphism）标记:
单核苷酸多态性。不同个体基因组DNA序列同一位置上的 单个核苷酸的差别。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同 序列长度里的单个碱基的差别。
第二节：遗传作图
5.1 经典的遗传学图谱:
主要用来确定生物体的基因在染色体上的排列，只能标明基因 之间的相对位置，无法指明基因在染色体上的具体位置，因此无法 按图直接克隆分离基因。 5.2 现 代 遗传学图谱： 其概念是David Botstein等 于1980年提出来的，当时由于DNA 限制性内切酶和连接酶的应用，RFLP成为一种崭新的DNA多态性 标记。他们提出来利用RFLP作为标记去构建多态性基因与这些标 记连锁关系，进而确定多态性基因的位置。其精髓在于将单纯的表 型研究深入到DNA分子的本质上去。 即：表型多样性对应于DNA分子的多样性 将单纯的表现多态性的界标改变为以DNA序列的多态作为作图 界标。这些界标包括： RFLP、 VNTR和STR等。
解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针
与之杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。 ( 图 Southern )
1 2 3 4
(A)
ZCL ZZA
1 The polymorphism of RFLP marker RG214 between 2 parents and 2 bulks
1.形 态 标记： 是指那些能够明确显示遗传多态的外
观性状，如株高、粒色等的相对差异 2.细胞学标记 ：是指能够明确显示遗传多态的细胞学特征。
如染色体结构上和数量上的遗传多态性等。
3.蛋白质标记：非酶蛋白质和酶蛋白质 在非酶蛋白质中，用得较多的是种子贮藏蛋白；
酶蛋白质主要是同功酶。
4.DNA 标 记： 也称DNA多态性标记、 DNA分子标记， 是 DNA水平上遗传多态性的直接反映。
功能克隆（functional cloning）采用的是从 蛋白质到DNA的研究路线，针对的是一些对影 响疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病
1．依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因 2．用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因
（二）从疾病的表型差异出发发现疾病相 关基因
表型克隆（phenotype cloning）基于对疾病 表型和基因结构或基因表达的特征联系已经有所 认识的基础上来分离鉴定疾病相关基因
针对未知基因常用的技术有
mRNA差异显示（mRNA differential display，mRNA-DD） 抑制消减杂交（suppressive substractive hybridization，SSH）
基因表达系列分析（SAGE）
cDNA微阵列 （cDNA microarray） 基因鉴定集成法 （integrated procedure for gene identification）
确定疾病的遗传因素，即通过孪生子分析，
领养分析和同胞罹患率分析等确定遗传因素
是否在疾病发病中的作用及其作用程度。
一、不依赖染色体定位的疾病相关基 因克隆策略
不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策
略包括功能克隆、表型克隆及采用位点非依赖
的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾
病基因。
（一）从已知蛋白质的功能和结构出发鉴 定克隆疾病基因
2. 双交换与染色体作图
但事实：
18.9 v 44.5 l 25.6 b
对于v与b而言，双交换类型与亲本型没有区别，
这就导致了前面在直接计算v与b之间的遗传图距
时出现偏低估计。由于双交换类型是两次单交换
的结果，为了对此进行校正，因此在计算v-b之间 的遗传图距时双交换类型必须计入两次：
Rfv-b＝[(③＋④＋⑤＋⑥)＋ 2(⑦＋⑧)]/1011 ＝45.5%
⑤
⑥ ⑦ ⑧
+bl
v++ ++l vb+ 总数
80
72 20 19 1011
＝36.8%
类型
① ②
F1配子基因型
vbl +++
数目
302 298
③
④ ⑤ ⑥ ⑦
+b+
v+l +bl v++ ++l
115
105 80 72 20
b-l的四种基因型： bl＝①＋⑤＝302＋80＝382 ++＝②＋⑥＝298＋72＝370 b+＝③＋⑧＝115＋19＝134 +l＝④＋⑦＝105＋20＝125 同理可以判断b-l之间也是连锁的， 其中③、④、⑦、⑧为重组配子 类型，因此： Rfb-l＝(③＋④＋⑦＋⑧)/1011 ＝25.6%
依据DNA或mRNA的改变与疾病表型的关 系，可有几种策略：
1. 从疾病的表型出发，比较患者基因组 DNA 与正常人基因 组 DNA 的不同，直接对产生变异的 DNA 片段进行克隆， 而不需要基因的染色体位置或基因产物的其他信息。
2. 针对已知基因。如果高度怀疑某种疾病是由于某个特殊 的已知基因所致，可通过比较患者和正常对照间该基因表 达的差异来确定该基因是否为该疾病相关基因。 3. 针对未知基因的，可通过比较疾病和正常组织中的所有 mRNA的表达种类和含量间的差异，从而克隆疾病相关基 因。这种差异可能源于基因结构改变，也可能源于表达调 控机制的改变。
这里仅介绍遗传的分子标记中的几种重要的分子标记:
1.同工酶标记: 同工酶（Isozyme）是一类分子结构不同、 功能相似、催化同样的生化反应的酶。 同工酶标记是利用编码同工酶的等位基因与同工酶酶谱的 相关性及其共显性的特点进行染色体定位和遗传连锁分析。
2.DNA分子标记: